楊憲勇

(泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院，山東 泰安 271000)

北沙參為傘形科植物珊瑚菜Glehnia littora-lis Fr. Schmidt ex Miq.的干燥根及根莖[1]。北沙參具有解熱、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳、祛痰、強(qiáng)心、抗突變、調(diào)解免疫系統(tǒng)等多種藥理作用[2]。常應(yīng)用在抗衰老和癌癥化療后恢復(fù)體質(zhì)的中藥方劑中,為臨床常用中藥[3]。本實(shí)驗(yàn)探討北沙參超臨界二氧化碳(SFE-CO2)萃取物對(duì)免疫抑制C57BL/6J小鼠T淋巴細(xì)胞亞群影響，為其進(jìn)一步應(yīng)用與開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1藥物 注射用環(huán)磷酰胺(CTX)，批號(hào)：11102305，上海華聯(lián)制藥有限公司產(chǎn)品；注射用生理鹽水(NS)，批號(hào)：1D11061709；北沙參SFE-CO2萃取物由泰山醫(yī)學(xué)院動(dòng)脈粥樣硬化研究所惠贈(zèng)；二甲亞砜(DMSO)。

1.1.2動(dòng)物 清潔級(jí)C57BL/6J小鼠，6～7周齡，18～22 g，泰山醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室惠贈(zèng)，動(dòng)物飼養(yǎng)溫度(23±2)℃，相對(duì)濕度(50±5)%，自由進(jìn)食和飲水。

1.1.3試劑 CD3-FITC，CD4-PE，CD8-PE熒光單抗，批號(hào)：11101207，USA Biolegen 公司；溶血素，批號(hào)：11091902，USA BD公司。

1.1.4儀器 FACScaliur流式細(xì)胞儀 ，USA BD公司；B160A型水平離心機(jī)，河北白洋離心機(jī)廠；全自動(dòng)生化儀，日本日立公司；三分類血球計(jì)數(shù)儀，日本日立公司。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組 采用正常C57BL/6J雌性小鼠，隨機(jī)分為4組，每組8只： 第1組為正常對(duì)照組，第2組為免疫抑制組，第3組為北沙參SFE-CO2萃取物高劑量組，第4組為北沙參SFE-CO2萃取物低劑量組。第1組連續(xù)6天靜滴DMSO 0.1 ml，前3天連續(xù)靜滴0.1 ml NS；第2組連續(xù)6天靜滴DMSO 0.1 ml，前3天靜滴80 mg/(kg·d) CTX；第3組連續(xù)6天靜滴4 g/kg(北沙參生藥)的北沙參SFE-CO2萃取物的DMSO溶液，前3天靜滴80 mg/(kg·d) CTX；第4組連續(xù)6天靜滴劑量為2 g/kg(北沙參生藥)的北沙參SFE-CO2萃取物的DMSO溶液，前3天靜滴80 mg/(kg·d) CTX[4]。

1.2.2外周血白細(xì)胞(WBC)、紅細(xì)胞(RBC)、血小板(PLT)的測(cè)定 第7天處死小鼠，眼靜脈取血，EDTA抗凝，血球計(jì)數(shù)儀自動(dòng)檢測(cè)WBC、RBC、PLT。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)分析 取EDTA抗凝全血100 μl，分別加入3只上樣管，管1加入鼠抗鼠IgG1-FITC、IgG1-PE各20 μl；管2加入CD3-FITC、CD4-PE各20 μl；管3加入CD3-FITC、CD8-PE各20 μl；室溫避光孵育15 min。加入裂解液1 ml，室溫避光8 min，500 r/min離心5 min，0.9%NS洗2次，500 μl NS重懸，上機(jī)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其陽(yáng)性表達(dá)率。根據(jù)T細(xì)胞亞群比例和細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)，計(jì)算T細(xì)胞亞群絕對(duì)數(shù)量[5]。

2 結(jié) 果

2.1北沙參SFE-CO2萃取物對(duì)CTX誘導(dǎo)免疫抑制C57BL/6J小鼠外周血WBC、RBC、PLT的影響

北沙參SFE-CO2萃取物能顯著提高CTX誘導(dǎo)免疫抑制C57BL/6J小鼠外周血WBC和PLT的數(shù)量(P<0.05)，但未達(dá)到正常對(duì)照組的水平，北沙參SFE-CO2萃取物不同濃度間無(wú)顯著差異。見表1。

表1 北沙參SFE-CO2萃取物對(duì)免疫抑制C57BL/6J小鼠WBC、RBC和PLT的影響

2.2北沙參SFE-CO2萃取物對(duì)CTX誘導(dǎo)免疫抑制C57BL/6J小鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群的影響

北沙參SFE-CO2萃取物能提高免疫抑制C57BL/6J小鼠CD3+T 、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T細(xì)胞在外周血的含量 (P<0.05) ，北沙參SFE-CO2萃取物低劑量時(shí)提高免疫抑制C57BL/6J小鼠CD3+CD4+T細(xì)胞的作用比高劑量強(qiáng)(P<0.05)；高劑量時(shí)提高免疫抑制C57BL/6J小鼠CD3+CD8+T細(xì)胞的作用比低劑量強(qiáng)(P<0.05)；但兩組數(shù)值都低于正常對(duì)照組(P<0.05)。

北沙參SFE-CO2萃取物低劑量時(shí)，CD3+CD4+T/CD3+CD8+T比值與正常對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)，說(shuō)明低劑量北沙參SFE-CO2萃取物已使免疫抑制的小鼠CD3+CD4+T/CD3+CD8+T比值恢復(fù)到正常水平；高劑量北沙參SFE-CO2萃取物不能提高CD3+CD4+T/CD3+CD8+T比值。見表2。

表2 北沙參SFE-CO2萃取物對(duì)CTX誘導(dǎo)免疫抑制C57BL/6J小鼠T淋巴細(xì)胞亞群的影響

3 討 論

北沙參屬常用補(bǔ)陰藥，多用于陰虛肺熱等癥，具有補(bǔ)虛扶正祛邪的功效，可增強(qiáng)細(xì)胞免疫、體液免疫[6]。北沙參SFE-CO2萃取物中的很多成分具有生物活性，其中2,6-十六烷基-1-(+)-抗壞血酸酯具有抗老化、抗不良刺激、活血化淤、免疫調(diào)節(jié)[7]等功效；角鯊烯是一種脂質(zhì)不皂化物，具有提高體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性、增強(qiáng)機(jī)體免疫能力、抗腫瘤等多種生理功能[8]。

骨髓是人和哺乳動(dòng)物的造血器官和中樞免疫器官，骨髓抑制是化療藥物最明顯毒副作用之一[5]。外周WBC是機(jī)體抵御外界微生物的重要組成部分，其壽命短暫，需骨髓干細(xì)胞源源不斷分化補(bǔ)充。本實(shí)驗(yàn)觀察到化療藥物CTX導(dǎo)致C57BL/6J小鼠的外周血WBC數(shù)量減少，北沙參SFE-CO2萃取物可以明顯增加免疫抑制C57BL/6J小鼠外周血中WBC數(shù)量，表明北沙參SFE-CO2萃取物可拮抗CTX所導(dǎo)致的WBC的減少，具有增強(qiáng)免疫抑制C57BL/6J小鼠的免疫功能。

T淋巴細(xì)胞主要介導(dǎo)機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞免疫功能，包括CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)觀察到，北沙參SFE-CO2萃取物可顯著提高免疫抑制C57BL/6J小鼠外周血中CD3+T、CD4+T和CD8+T細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量，提示北沙參SFE-CO2萃取物對(duì)免疫抑制C57BL/6J小鼠的細(xì)胞免疫具有改善作用。

本實(shí)驗(yàn)初步研究了北沙參SFE-CO2萃取物對(duì)免疫抑制C57BL/6J小鼠外周血WBC數(shù)與外周血T細(xì)胞亞群細(xì)胞數(shù)量的影響，結(jié)果提示北沙參SFE-CO2萃取物對(duì)免疫抑制C57BL/6J小鼠外周免疫系統(tǒng)有較顯著的恢復(fù)作用，其分子機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

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