王 宇, 李 莉 張守都, 鄭懷平, 張國(guó)范

(1. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 2. 中國(guó)科學(xué)院 研究生院 北京 100049; 3. 汕頭大學(xué), 廣東汕頭 515063)

海灣扇貝雜交、近交和自交家系的微衛(wèi)星標(biāo)記偏分離分析

王 宇1,2, 李 莉1, 張守都1,2, 鄭懷平3, 張國(guó)范1

(1. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 2. 中國(guó)科學(xué)院 研究生院 北京 100049; 3. 汕頭大學(xué), 廣東汕頭 515063)

海灣扇貝(Argopecten irradians)是典型的雌雄同體型貝類(lèi), 行體外受精, 能自體受精也能異體受精, 因此可產(chǎn)生3種不同形式的交配方式： 雜交(Out bred)、近交(Inbred)和自交(Selfing)。本研究篩選了10對(duì)多態(tài)性微衛(wèi)星引物對(duì)海灣扇貝4個(gè)不同近交梯度共8個(gè)家系基因型進(jìn)行了遺傳分離分析。從偏分離標(biāo)記的個(gè)數(shù)來(lái)看, 雜家家系最多, 其次是自交一代和自交二代, 最后是近交家系。結(jié)果表明只有自交家系后代基因型存在純合子缺失, 部分證明了顯性遺傳效應(yīng), 同時(shí)篩選出 3個(gè)與有害基因連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記。

海灣扇貝(Argopecten irradians); 近交衰退; 微衛(wèi)星; 偏分離

海灣扇貝(Argopecten irradians)1982年引入中國(guó)[1], 其人工養(yǎng)殖在中國(guó)迅速開(kāi)展, 在世界上首次形成海灣扇貝養(yǎng)殖業(yè)[2-3]。海灣扇貝是典型的雌雄同體型貝類(lèi), 雌雄性腺發(fā)育基本同步, 且行體外受精, 體外發(fā)育。研究顯示, 海灣扇貝可以自體受精, 也可以異體受精, 即同時(shí)存在自交和雜交兩種交配方式,且后代均可以正常發(fā)育和存活, 它是遺傳育種學(xué)研究的理想貝類(lèi)。近交(Inbreeding)是彼此具有一定親緣關(guān)系的個(gè)體間的相互交配, 自交是一種極端形式的近交。近交導(dǎo)致與繁殖力和生理機(jī)能相關(guān)的性狀的表型平均值降低, 這種現(xiàn)象稱(chēng)為近交衰退(Inbreeding depression); 同時(shí)近交使生物的基因雜合度降低。近交衰退現(xiàn)象被人們熟知已經(jīng) 2個(gè)世紀(jì)有余[4]。依照顯性理論, 生物的近交衰退是由于隱性致死或其他有害基因純合機(jī)率增加, 導(dǎo)致生物適合度性狀(Fitness trait)或者生存能力(Viability)降低造成的[5]。和這類(lèi)有害基因連鎖的標(biāo)記在家系中的分離傾向于不符合孟德?tīng)栆?guī)律, 也就是標(biāo)記偏分離現(xiàn)象[6]。因此, 偏分離標(biāo)記是隱性有害基因存在的重要分子效應(yīng), 為研究有害基因提供了一條更加直接的途徑。本文通過(guò)分析微衛(wèi)星標(biāo)記在近交程度不同的海灣扇貝雜交、近交和自交家系的分離情況, 來(lái)研究近交過(guò)程中有害基因的清除, 尋找與有害基因連鎖的分子標(biāo)記或基因, 確定有害基因的數(shù)目和效能, 以期闡釋海灣貝近交衰退遺傳機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)利用8個(gè)不同近交梯度的海灣扇貝家系(表1), 提取閉殼肌組織DNA進(jìn)行微衛(wèi)星分析。

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

OMEGA公司SQ 組織DNA提取試劑盒, 引物來(lái)源參見(jiàn)李宏俊的博士論文[7], 由上海生工合成,Taq酶和 PCR Reaction MIX 購(gòu)自東盛生物公司,5×TBE緩沖液、40%聚丙烯酰胺溶液、TEMED購(gòu)自生工。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

Mikro 22R高速冷凍離心機(jī), 博日 PCR儀,ATTO電泳槽, Wide Mini Sub TM Cell凝膠成像系統(tǒng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取

利用OMEGA 公司的SQ組織DNA提取試劑盒從海灣扇貝閉殼肌組織中提取基因組DNA。

表1 實(shí)驗(yàn)用扇貝家系信息Tab. 1 Information of bay scallop involved

1.2.2 PCR擴(kuò)增

優(yōu)化的微衛(wèi)星PCR反應(yīng)體系(15 μL)中含1×PCR Reaction MIX(包括 1.5 mmol/L Mg2+、200 μmol/L dNTPs), 正反向引物各 0.34 μmol/L, 0.34UTaq 酶(東盛)和50 ng基因組DNA。熱循環(huán)程序?yàn)?4°C預(yù)變性3 min; 94°C變性30 s, 49～65℃下復(fù)性30 s(表2中各座位的退火溫度), 72°C延長(zhǎng)40 s, 循環(huán)30次; 最后在72°C延伸7 min, 4℃保存。

1.2.3 電泳及結(jié)果記錄

PCR產(chǎn)物的檢測(cè)采用12%非變性聚丙烯酰胺凝膠300 V電泳2～3 h, 溴化乙錠染色分型后用凝膠成像系統(tǒng)及相關(guān)軟件(Quantity One)進(jìn)行分型。每個(gè)微衛(wèi)星座位根據(jù)電泳遷移率辨別等位基因, 從大到小依次記錄為a、b、c、d, 無(wú)擴(kuò)增條帶則為無(wú)效等位基因, 擴(kuò)增帶為1條的為純合子, 2條的則為雜合子,列出雙親和子代個(gè)體的基因型矩陣用于統(tǒng)計(jì)分析, 用Excel的χ2檢驗(yàn)功能檢驗(yàn)各位點(diǎn)子代個(gè)體基因型是否符合孟德?tīng)栠z傳比例

1.2.4 微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選

用8個(gè)家系共12個(gè)父母本篩選引物, 自交家系父母本在這個(gè)位點(diǎn)必須是雜合的, 近交和雜交家系父母本基因型有一個(gè)是雜合就說(shuō)明所有的子代在這個(gè)位點(diǎn)有多態(tài)性(圖 1)。從 44對(duì)微衛(wèi)星引物中篩選10對(duì)具有多態(tài)性的引物(表 2)用于所有家系的偏分離分析。

2 結(jié)果

2.1 微衛(wèi)星引物在各家系的分離情況

分別對(duì)44個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在不同家系中的分離情況進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析(圖2), 篩選出10對(duì)在各家系都有分離信息的位點(diǎn), 占位點(diǎn)總數(shù)的 22.72%。結(jié)果表明近交和雜交家系中有分離信息的位點(diǎn)較自交家系多,證明他們的雜合子比例較自交家系高。另外只有在自交家系中發(fā)現(xiàn)了純合子缺失的位點(diǎn), 在近交和雜交家系中不存在。

圖1 父母本在位點(diǎn)HWAD190的聚丙烯酰胺電泳圖Fig. 1 PAGE photograph of pleomorphic locus of HWAD190

另外, 各家系發(fā)生偏分離位點(diǎn)的個(gè)數(shù)見(jiàn)圖 3, 雜交家系發(fā)生偏分離的位點(diǎn)最多, 其次是自交和自交二代家系, 最后是近交家系。

2.2 各位點(diǎn)偏分離的P值檢驗(yàn)

根據(jù)孟德?tīng)栠z傳的分離和自由組合定律, 對(duì)各家系在特定座位的基因型比例進(jìn)行了 χ2檢驗(yàn), 當(dāng)P＞0.05時(shí), 符合孟德?tīng)栠z傳, 當(dāng)P＜0.05時(shí), 顯著偏離孟德?tīng)柗蛛x定律。各家系在每個(gè)座位基因型統(tǒng)計(jì)及偏分離(P＜0.05)的情況見(jiàn)表 3, 各家系偏分離的位點(diǎn)數(shù)見(jiàn)表3。

2.3 自交家系發(fā)生嚴(yán)重偏分離的標(biāo)記

由表3可以看出, 在Add026(LG11)這個(gè)座位, 3個(gè)自交一代家系都發(fā)生了偏分離, 在 CC5-3和CC5-4兩個(gè)家系中出現(xiàn)了純合子缺失的情況, 缺少bb 這種基因型, 在 CC5-1 家系 aa：ab：bb=3：21：5, bb 這種基因型也很少, 推測(cè) b可能是一個(gè)有害的等位基因, Add026這個(gè)座位可能與有害基因連鎖。另外,CC5-3和CC5-4這兩個(gè)家系在HWAD190(LG7)這個(gè)座位都有 bb型純合子的缺失, 在另一個(gè)自交家系CC5-1中則未發(fā)生偏分離, 這個(gè)位點(diǎn)有可能跟有害基因連鎖。

表2 實(shí)驗(yàn)用所有家系都有分離信息的引物信息表Tab. 2 Information of SSR primers segregated in all genetic lineages

圖2 微衛(wèi)星位點(diǎn)在各家系的分離情況Fig. 2 Segregation of loci in eight families

圖3 各家系偏分離位點(diǎn)數(shù)Fig. 3 Numbers of segregation distortion loci in each family

在ASD258(LG1)這個(gè)生長(zhǎng)性狀連鎖座位, CC5-1,CC5-3, O9這3個(gè)自交家系也都有bb型純合子的缺失, 其P值P(CC5-3)＞P(CC5-1)＞P(O9)(其中P(CC5-3)=0.0272;P(CC5-1)=0.0027;P(O9)=0.0014),近交二代偏分離程度比一代高, 說(shuō)明有害基因沒(méi)有被完全剔除, 自交的過(guò)程仍然有有害基因被剔除。

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2.4 生長(zhǎng)性狀連鎖位點(diǎn)在自交家系中的子代基因純合率分析

基因純合率是每個(gè)個(gè)體的純合座位與全部座位數(shù)的比率, 近交的結(jié)果使基因趨向純合, 因此基因純合率很大程度上反應(yīng)一個(gè)群體的近交程度。在Add154(LG8)和 Asd258(LG1)這兩個(gè)與生長(zhǎng)性狀連鎖的微衛(wèi)星位點(diǎn)[7], 4個(gè)自交家系中有3個(gè)自交家系子代基因的純合率都低于50%(表5), 說(shuō)明純合子在子代中的比例減低了, 與近交衰退產(chǎn)生的生長(zhǎng)性狀表型平均值降低相吻合。

表4 10個(gè)座位在各家系發(fā)生偏分離情況(黑點(diǎn)代表有偏分離(P<0.05))Tab. 4 Segregation distortion of 10 loci in 8 families (dark spot means distortion of Segregation ratios (P<0.05))

表5 生長(zhǎng)相關(guān)位點(diǎn)在自交家系中的基因純合率Tab. 5 Rates of homozygote for growth related microsatellite loci in inbreeding lineages

3 討論

關(guān)于引起近交衰退的機(jī)制目前有兩種假設(shè)： 一個(gè)是“顯性假說(shuō)”[8-9], 認(rèn)為在近交的群體內(nèi), 突變-選擇平衡產(chǎn)生大量的隱性或近隱性的有害基因?qū)е铝私凰ネ? 另一種是“超顯性假說(shuō)”[8,10-11], 即雜合位點(diǎn)具有雜合優(yōu)勢(shì), 近交所導(dǎo)致的雜合子減少是性狀衰退的原因。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)統(tǒng)計(jì)各個(gè)位點(diǎn)在自交家系中純合基因型是否嚴(yán)重減少或缺失, 發(fā)現(xiàn)有 3個(gè)座位在不同自交家系中都存在純合子的缺失現(xiàn)象,這 3個(gè)座位分布位于不同的連鎖群上, 這表明隱性有害基因在近交中作用非常重要, 且近交衰退涉及到多個(gè)相關(guān)基因,一定程度上符合“顯性假說(shuō)”。

由于本研究所利用的所有家系的遺傳背景不完全一致, 所以很難對(duì)偏分離標(biāo)記的數(shù)量隨近交程度的遞增做整體評(píng)價(jià)。其中CC系列的3個(gè)自交家系和2個(gè)近交家系相比, 其偏分離程度增加, 部分驗(yàn)證了偏分離標(biāo)記隨著近交程度的增加而增加。自交二代O9的偏分離比例比自交一代(3個(gè)CC5自交系)偏分離比例高, 但是因其遺傳背景不完全相同, 故很難直接對(duì)近交程度對(duì)偏分離的影響做出結(jié)論。而雜交家系 NS2-DQ6和 D1-1.4中也分別出現(xiàn)了 5個(gè)和 7個(gè)偏分離位點(diǎn), 較高偏分離標(biāo)記的原因很可能是因?yàn)檫@些雜交家系的遺傳背景比較復(fù)雜, 而遺傳背景較大的個(gè)體雜交染色體的配對(duì)和重組會(huì)受到抑制,會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的偏分離[12-14]。雜交家系較高的偏分離比例也可能是因?yàn)楹Y選出的10個(gè)引物大多來(lái)源于染色體的偏分離的熱點(diǎn)區(qū)域[7]。

本研究從偏分離標(biāo)記這一方面部分證實(shí)了近交衰退導(dǎo)致偏分離且偏分離程度與近交系數(shù)有一定的正相關(guān), 自交過(guò)程還存在有害致死基因的剔除。本實(shí)驗(yàn)只篩選了10對(duì)多態(tài)性引物, 達(dá)不到定位有害基因的目的, 發(fā)生偏分離的位點(diǎn)越集中在染色體上的某一區(qū)域, 那么這一區(qū)域存在有害基因的可能性越大,要確定有害基因的位置、數(shù)目和效能最好篩選出更多的有分離信息的引物或者通過(guò)比較背景環(huán)境相同的自交和雜交家系的mRNA的表達(dá)譜來(lái)確定表達(dá)差異明顯的基因(相關(guān)表達(dá)譜工作已經(jīng)開(kāi)始進(jìn)行)。設(shè)計(jì)微衛(wèi)星引物來(lái)進(jìn)一步確定偏分離現(xiàn)象, 把近交衰退的表型性狀、QTL和分子標(biāo)記融為一體, 更加直觀地體現(xiàn)近交是如何通過(guò)相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控最終導(dǎo)致表型性狀的衰退。

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Microsatellite segregation distortion analysis of the out bred,inbred and selfed families of the Bay scallop(Argopecten irradians)

WANG Yu1,2, LI Li1, ZHANG Shou-du1,2, ZHENG Huai-ping3, ZHANG Guo-fan1
(1. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Graduate University, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3. Shantou University, Shantou 515063,China)

Jan.,4,2011

Argopecten irradians; Inbreeding depression; SSR; Segregation distortion

The bay scallop(Argopecten irradians)is a hermaphroditic marine bivalve. It has male and female gonads simultaneously, and exerts external fertilization. So it has three breeding manners： outbreeding, inbreeding and selfing. In this study, 10 microsatellites primers were used to test the segregating distortion in two outbred, two inbred and four selfed families (three selfing for the first generation and 1 for the second generation). The outbred families were found to have the most segregated markers, followed by the selfed families for the first generation and the selfed-families for the second generations, and the inbred families were found to have the least segregated markers. The homozygote deficiency loci was only found in the selfed families, which means partial dominance may be the genetic basis of inbreeding, and we also found three markers might be linked to the lethal genes.

S917.4

A

1000-3096(2012)08-0109-07

2011-01-04;

2011-04-10

國(guó)家自然科學(xué)基金(30800842); 國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863項(xiàng)目, 2012AA10A410); 中國(guó)科學(xué)院知識(shí)創(chuàng)新工程青年人才領(lǐng)域前沿項(xiàng)目以及中國(guó)博士后基金(20090451358)

王宇(1986-), 女, 湖北鄂州人, 碩士研究生, 從事海洋分子生物學(xué)研究, E-mail：iocaswy@163.com; 張國(guó)范, 通信作者, 研究員, 電話： 0532-82898701, E-mail： gfzhang@qdio.ac.cn

張培新)