金浩，李柏林，歐杰，陳蘭明*

(1.上海海洋大學食品學院，上海201306;2.上海海洋大學，上海201306)

活性污泥法是工業(yè)化國家最常見的污水生物應用處理技術。用于處理生活廢水及工廠污水的活性污泥成分復雜，不僅有來自于污水的難降解有機物，被污泥絮體吸附的無機物，還包括有代謝功能的活性微生物群體，微生物內源呼吸和自身氧化的殘留物。能降低污水中復雜成分的材料是一種生物性的絮狀材料，主要有腐生性營養(yǎng)細菌、原生動物和細胞外高分子物質(EPS)［1］。微生物不僅參加一些小分子細胞新陳代謝，而且通過酶的水解作用使得大部分大分子有機物通過一系列的水解反應變成可被細菌細胞吸收系統(tǒng)吸收的較小單位的物質。而這些未知的微生物蘊含著一個寶貴的有可能獲得新酶的潛在資源。近年來，宏基因組技術已經(jīng)成功地應用在從各種環(huán)境中的未培養(yǎng)微生物中獲得新型微生物產(chǎn)物［2］。本研究通過非培養(yǎng)宏基因組技術研究位于中國上海污水處理系統(tǒng)中活性污泥的多樣性。要在如此復雜的樣品中獲得較為純凈且完整度高的DNA具有一定難度。本實驗宏基因組DNA的提取方法是根據(jù)Zhou J等［3］提出的原位提取法并做了一些修改，以保持環(huán)境樣品中DNA的完整性和純度，并通過16S rDNA PCR來驗證活性污泥宏基因組DNA的細菌多樣性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集樣品來自污水處理工廠(處理工業(yè)和市政廢水，上海)，用無菌采樣袋裝盛并密封，立即存于冰盒運至實驗室。

1.1.2 主要試劑DNA提取緩沖液:Tris-HC1 100 mmol/L，EDTA 100 mmol/L，NaCl 1.5 mol/L和1%(質量體積比)溴化十六烷基三甲基銨(Sigma-Aldrich，美國)，pH 8.0;Premix Ex Taq，購自上海生工生物有限公司;Axygen DNA凝膠回收試劑盒，購自愛思進生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 活性污泥宏基因組DNA的提取活性污泥總DNA具體的提取方法如下:取活性污泥樣品50 g和135 mL的DNA提取緩沖液加入到150 mL離心管中，置于37℃充分混合0.5 h。然后加入0.5 mL蛋白酶K和2.0 mL 20%SDS溶液，置于50℃水浴反應3 h，并每20 min上下顛倒混勻。在25℃下6 000 r/min離心10 min，收集上清液，然后加入等體積氯仿/異丙醇(24∶1)混合液，上下顛倒混勻后，4℃，12 000 r/min離心10 min，吸取含有DNA的上層水相。向水相中加入0.1倍水相體積3 mol/L醋酸鈉(pH 5.3)和2倍水相體積無水乙醇，上下顛倒混勻30 s，放在-20℃2 h。然后4℃，13 000 r/min離心15 min。去掉上清液，加入2 mL 70%乙醇洗滌，洗掉酒精并晾干。用200 μL Mili-Q無菌水溶解宏基因組DNA，-20℃保藏。

1.2.2 宏基因組DNA純化及濃度測定通過割膠回收對DNA進行純化處理，方法參照Axygen DNA凝膠回收試劑盒，回收的宏基因組DNA的濃度通過SAM1000分光光度計進行測定。

1.2.3 16S rDNA PCR擴增DNA的提取質量通過進行細菌16S rDNA PCR。PCR反應體積為20 μL，反應體系為DNA模板1 μL，Premix Ex Taq 1 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O添至總體積為20 μL。16S PCR的通用引物為27F和1492R，上游引物27F:5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇，下游引物1492R:5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇。PCR反應條件:最初變性溫度的95℃5 min;隨后94℃變性30 s，58.3℃退火30 s，72℃延伸90 s，30個循環(huán);最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物的檢測是通過1%的瓊脂糖凝膠電泳。PCR產(chǎn)物經(jīng)過割膠回收純化。

1.2.4 16S rDNA文庫的建立純化后的PCR產(chǎn)物與pGM-T載體(TaKaRa中國大連)連接，連接產(chǎn)物轉化到TOP10感受態(tài)細胞(上海生工生物有限公司)中，涂布于表面加入16 μL的IPTG(50 mg/mL)、40 μL X-gal(20 mg/mL)的LB(Amp+)固體培養(yǎng)基上，隨機挑取陽性克隆于LB(Amp+)液體培養(yǎng)基中，提取質粒并送上海生工生物公司測序。

1.2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹的建立將16S rDNA的核苷酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進行Blast比對，并獲得相似種屬。序列以FASTA格式輸入BioEdit，并用Clustal W2功能進行比對。比對結果輸入分析軟件MEGA4(version 4.0)中，激活后進行neighborjoining建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 活性污泥的宏基因組DNA提取

直接法提取到的DNA呈深褐色并伴有大量絮狀物，說明DNA粗提液中仍然包含著各種一同抽提出來的色素或其他雜質。

圖1 活性污泥宏基因組DNA電泳結果Fig.1 Agarose gel electrophoresis analysis of metagenomic DNA extracted from activated sludge sample M:λDNA/HindⅢladder;1～3:提取的宏基因組DNA M:λDNA/HindⅢladder;1～3:Metagenomic DNA extracted

由圖l可知，提取的DNA片段大約23.1 kb，電泳拖尾現(xiàn)象嚴重，說明DNA純度不高。條帶亮度高說明DNA提取量很高。經(jīng)過割膠純化后，DNA純度提高，片段大小幾乎沒有改變。

2.2 16SrDNA PCR克隆文庫建立

以活性污泥總DNA為模板擴增得到約1.5 kb的16S rDNA產(chǎn)物，與預期片段大小相符。

測序共獲得195條高質量16S rDNA序列，通過Blast程序進行比對檢索，并構建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2，得到與序列最相似的細菌種類。比對結果表明，活性污泥16S rDNA克隆文庫與GenBank數(shù)據(jù)庫中的同源序列均來自于環(huán)境樣品，與Gen-Bank數(shù)據(jù)庫中已知16S rDNA序列的相似性均高達97%以上。

圖2 16SrDNA克隆文庫的系統(tǒng)發(fā)育樹圖Fig.2 Phylogenetic tree of deduced carboxypeptidase amino acid sequences obtained from microbial community of activated sludge samples

195個克隆中，變形菌門是最明顯的優(yōu)勢類群。包括β-變形菌門(β-Proteobacteria)中產(chǎn)堿桿菌屬Alcaligenes(107個克隆)、Aquabacterium(1個克隆)、Oxalicibacterium(1個克隆)、Massilia(1個克隆)、Comamonas(1個克隆);γ-變形菌門(γ-Proteobacteria)中Oceanimonas(3個克隆)、Oceanisphaera(1個克隆)、Enterobacter(3個克隆)、Vibrio(6個克隆)、Pseudomonas(25個克隆)、Acineto-bacter(2個克隆)、Xanthomonas(3個克隆)、Stenotrophomonas(25個克隆)。其余克隆子鑒定到菌屬水平的包括:厚壁胞門(Firmicutes)中芽胞桿菌屬Bacillus(4個克隆)、腸球菌屬Enterococcus(4個克隆)、漫游球菌屬Vagococcus(1個克隆);擬桿菌門(Bacteroidetes)中Myroides(4個克隆);硝化螺菌門(Nitrospirae)中Candidatus Nitrospira defluvii(2個克隆);綠彎菌門(Chloroflexi)中Herpetosiphon(1個克隆)。

3 討論

宏基因組DNA的提取是研究活性污泥樣品的第一步，DNA的提取包含DNA產(chǎn)量、DNA純度和DNA對整個微生物群落的代表性等方面。本實驗研究對象為活性污泥樣品，其復雜的物理特性及物質成分無法用現(xiàn)有的試劑盒提取DNA，因此選擇直接法對樣品進行提取宏基因組DNA。根據(jù)Zhou J等提出的原位提取法，抽提的宏基因組DNA電泳圖顯示出本實驗的提取方法可以獲得較高濃度且保持較大長度的DNA片段，同時DNA粗提液顏色呈黃褐色，仍包含很多雜質，需要進一步純化。

污水處理活性污泥16S rDNA文庫中的克隆Blast比對結果顯示，與GenBank數(shù)據(jù)庫的最相似序列基本來自于環(huán)境樣品，文庫中的序列與已培養(yǎng)細菌的16S rDNA序列相似性高于97%，即鑒定到菌屬。結果表明，污水處理活性污泥的微生物以變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門為主。本研究還在活性污泥中發(fā)現(xiàn)了綠彎菌門和硝化螺菌門細菌類群。這些結果說明，污水處理活性污泥中微生物種類非常豐富，且部分克隆子與GenBank數(shù)據(jù)庫中未培養(yǎng)的環(huán)境細菌序列最相似，若單純利用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法對活性污泥菌群進行研究是不充分的。16S rDNA克隆文庫方法為活性污泥細菌多樣性提供一個更加全面的認識，對細菌進行功能研究有極大幫助，包括特定培養(yǎng)基的設定以及相關基因序列的搜索。但對活性污泥的真核生物多樣性研究則需建立18S rDNA文庫。

本研究的16S rDNA克隆比對結果顯示出3個較優(yōu)勢的菌屬。近55%的克隆與Alcaligenes feacalis相似性高達99%，產(chǎn)堿桿菌屬存在于各種環(huán)境中并可以分泌蛋白酶［4］、幾丁質酶［5］、腈水解酶［6］等，對污水中的有機質有水解作用，其硝化作用也可將污水中的氮元素降解為N2O或N2［7］。與25個克隆相似度為98%的優(yōu)勢菌為Pseudomonas aeruginosa，假單胞菌是一種廣泛分布于自然界的常見的病菌，是自然界中碳、氮循環(huán)的重要一環(huán)［8］，分解蛋白質和酯酶能力很強［9］。同樣有25個克隆與已知序列相似性高達99%的菌為Stenotrophomonas sp.，Stenotrophomonas sp.最初被分作假單胞菌屬，后被確認為寡養(yǎng)單胞菌屬，寡言單胞菌同樣有很強的產(chǎn)蛋白酶能力［10］和產(chǎn)酯酶能力。亞硝酸鹽氧化細菌Candidatus Nitrospira defluvii，是一個在處理工業(yè)污染和廢水的生物污水處理系統(tǒng)中［11］重要的硝化細菌。W35序列顯示了與Comamonas的98%的相似之處，這種菌被普遍發(fā)現(xiàn)在源于城市和工業(yè)廢水處理廠的活性污泥樣品［12］。另外還有自然的清道夫之稱的Herpetosiphon aurantiacus［13］，W33相似度為99%。這類細菌曾出現(xiàn)在污染水體中，說明它們可能在活性污泥中對污水處理過程發(fā)揮重要的生物處理功能。

同時，Alcaligenes feacalis是機會致病菌［14］，可以引起敗血癥、嬰兒腦膜炎等。Pseudomonas是一種致病力較低但抗藥性強的桿菌［15］，常見于傷口感染，也能產(chǎn)生多種與毒力相關的物質，如外毒素a。

本研究通過16S rDNA克隆文庫方法初步分析了污水處理活性污泥中微生物群落的多樣性。研究發(fā)現(xiàn)活性污泥中微生物種類很豐富，包括可能執(zhí)行很復雜的污水生物處理功能的微生物;同時，活性污泥中也存在著極多的細菌病原體。

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