丁國臣，王亞輝，司 迎，王 艷，曹志偉

IL－23在鼻息肉中的表達(dá)及其意義

丁國臣1，王亞輝1，司 迎2，王 艷1，曹志偉3

目的檢測IL－23在鼻息肉(nasal polyp，NP)組織中的表達(dá)，探討其在鼻息肉發(fā)病中的作用。方法收集15例鼻息肉標(biāo)本(NP組)和15例在鼻中隔偏曲矯正手術(shù)中根據(jù)需要部分切除下鼻甲黏膜組織(對照組)，分別采用免疫組織化學(xué)方法和RT－PCR方法檢測兩組IL－23蛋白和IL－23p19mRNA表達(dá)水平。結(jié)果NP組IL－23蛋白陽性表達(dá)炎性浸潤細(xì)胞數(shù)明顯多于對照組，單位目標(biāo)面積光密度均值(0.321±0.023)明顯高于對照組(0.199±0.011)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);IL －23p19mRNA 表達(dá)水平 (0.676±0.077)明顯高于對照組(0.212±0.015)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)。結(jié)論IL－23可能在參與了NP發(fā)病過程。

白細(xì)胞介素23;鼻息肉;免疫組化;逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

R765.22

鼻息肉(nasal polyp，NP)作為上氣道黏膜慢性炎性反應(yīng)的一部分，其發(fā)病機(jī)制與過敏性鼻炎、哮喘等極為相似，被公認(rèn)為是“同一氣道，同一疾病”［1］。研究發(fā)現(xiàn)，IL－23/IL－17軸更能科學(xué)地闡明慢性炎性反應(yīng)性疾病的發(fā)病機(jī)制［2，3］。該學(xué)說認(rèn)為，由炎性反應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生的IL－23刺激Th0細(xì)胞，向一種新的Th細(xì)胞亞型－Th17細(xì)胞分化，Th17細(xì)胞產(chǎn)生炎性反應(yīng)性細(xì)胞因子IL－17，后者具有強(qiáng)烈的致炎作用，從而導(dǎo)致多種炎性反應(yīng)的發(fā)生。本研究于2010－06至2010－12通過檢測IL－23在NP中的表達(dá)，探討IL－23在NP發(fā)病中的作用，以期為IL－23/IL－17軸在鼻息肉中的作用機(jī)制提供理論依據(jù)，并為重新認(rèn)識NP的發(fā)病過程和制訂治療策略提供參考。

1 對象與方法

1.1 對象 選取我院鼻息肉手術(shù)患者的鼻息肉組織(NP組)15例，男9例，女6例，年齡20～55歲，平均(39.50±3.21)歲;選取同期接受鼻中隔偏曲矯正術(shù)，且根據(jù)病情需要部分切除下鼻甲黏膜組織的患者15例作為對照組，男7例，女8例，年齡21～49歲，平均(35.70±2.95)歲。兩組患者術(shù)前嚴(yán)格進(jìn)行過敏性疾病問卷調(diào)查，均無多發(fā)性噴嚏、流水樣鼻涕，或發(fā)作性喘息等過敏性疾病史，術(shù)前4周內(nèi)均未接受過類固醇激素、抗組織胺類藥物治療及免疫治療。

1.2 標(biāo)本處理 標(biāo)本取材后平分為兩份，一份立即浸泡于10%中性甲醛固定液中固定，另一份立即投入液氮中冷凍保存。

1.3 主要試劑 兔抗人IL－23抗體(產(chǎn)品編號:bs－1193R)、SP試劑盒(通用型)、DAB顯色試劑盒均由北京博奧森生物科技有限公司提供。總RNA提取試劑(Trizol)由invitrogen公司提供，cDNA第一鏈合成試劑盒、Taq酶、DL2000 DNA marker由北京康為世紀(jì)生物科技有限公司提供。引物由北京三博遠(yuǎn)志生物科技有限公司合成。

1.4 免疫組織化學(xué)方法 采用SP法，染色步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。以PBS代替一抗作陰性對照，DAB顯色，光鏡下觀察陽性細(xì)胞。在清晰的背景上出現(xiàn)特異性棕黃色顆粒者為陽性，陰性對照無特異性著色。

灰度值測定:切片染色后，選擇染色良好區(qū)域，應(yīng)用Leica Q550CW圖像采集和分析系統(tǒng)，每份標(biāo)本選擇3張染色較好切片進(jìn)行觀察，每張切片在顯微鏡下(40×10)選取5個互不重疊視野，測定單位面積陽性細(xì)胞表達(dá)的平均光密度值作為其表達(dá)情況，取均值作為該份標(biāo)本IL－23蛋白的表達(dá)水平。

1.5 RT－PCR 用Trizol一步法提取總RNA。取1 μg總RNA用M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。IL－23p19mRNA的上游引物:(s)上游引物為:5'－ GAGCAGCAACCCTGAGTCCCTA －3'，下游引物為:5'－CAAATTTCCCTTCCCATCTAATAA －3'，擴(kuò)增片段長度為230 bp。內(nèi)參基因GAPDH上游引物:5'－TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGG －3'，下游引物:5'－CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC－3'，擴(kuò)增片段長度為287 bp。擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性2 min，94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 個循環(huán);進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳完畢后取出凝膠，在波長為254 nm的紫外燈下觀察，并在凝膠成像系統(tǒng)中拍照、保存，計算平均光密度比值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件，計量資料以±s表示，采用兩獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 IL－23p19mRNA表達(dá)水平 RT－PCR檢測顯示，NP組 IL－23p19mRNA相對表達(dá)水平為(0.676 ± 0.077)，明顯高于對照組 (0.220 ±0.015)，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)。

2.2 IL－23蛋白表達(dá)水平 對照組鼻黏膜中幾乎沒有IL－23陽性細(xì)胞存在(圖1A)，NP組鼻息肉組織中可見大量IL－23陽性的炎性細(xì)胞浸潤(圖1B)。NP組IL－23蛋白相對表達(dá)水平(0.821±0.023)明顯高于對照組(0.199 ±0.011)，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

圖1 人鼻息肉中IL－23的陽性表達(dá)(SP×400)

3 討 論

目前，NP確切的發(fā)病機(jī)制仍然不清楚，被公認(rèn)為是一種多致病因素參與的疾病實體，這些因素包括鼻腔鼻竇解剖結(jié)構(gòu)異常、感染與非感染性炎性反應(yīng)、免疫異常、遺傳因素等。關(guān)于NP發(fā)病過程，有多種學(xué)說解釋，包括自主神經(jīng)功能失調(diào)、離子通透性改變、氣流動力學(xué)說、感染學(xué)說和變態(tài)反應(yīng)學(xué)說等。隨著分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的進(jìn)展，變態(tài)反應(yīng)(allergic reaction，AR)及感染導(dǎo)致的炎性反應(yīng)學(xué)說越來越受到重視。白細(xì)胞介素作為細(xì)胞因子在鼻息肉發(fā)病中也發(fā)揮了重要作用，如 IL －1、3、4、5、6、8 等［4，5］。

IL－23是2000年發(fā)現(xiàn)的白細(xì)胞介素12家族成員，其主要結(jié)構(gòu)由p19和p40兩個亞單位組成，其中，p40與IL－12中的p40具有同源性，人和小鼠活化的樹突細(xì)胞(DC)、巨噬細(xì)胞(Mφ)、T細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞都能產(chǎn)生IL－23，但最主要由活化的DC產(chǎn)生［6］。IL－23的主要生物學(xué)功能是調(diào)解新的CD4+T細(xì)胞亞群(Th17細(xì)胞)產(chǎn)生IL－17，形成IL－23/IL－17軸而在自身免疫疾病、慢性炎性反應(yīng)性疾病中發(fā)揮重要作用［7－10］。IL－23通過此途徑與多種自身免疫性炎性反應(yīng)性疾病有關(guān)，并在局部組織重塑過程中起要作用，如自身免疫性腦脊髓膜炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、支氣管哮喘等［11－13］。IL －23 在過敏性鼻炎鼻黏膜中存在高表達(dá)［14］，但在NP中的表達(dá)狀態(tài)還不清楚。

本研究結(jié)果表明，IL－23在NP中表達(dá)明顯增高，說明IL－23可能參與了NP的發(fā)病過程，但其具體機(jī)制尚不清楚。深入研究NP中IL－23與其他白細(xì)胞介素家族成員的作用機(jī)制，將為認(rèn)識NP發(fā)病機(jī)制提供一條新的途徑，同時，針對IL－23的治療，可能會成為治療NP的一個新靶點。

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Expression of IL－23 in nasal polyps and its significance

DING Guochen1，WANG Yahui1，SI Ying2，WANG Yan1，and CAO Zhiwei3.1.Liaoning Provincial Corps Hospital;2.Liaoning Provincial Corps Department of Public Health，Chinese People’s Armed Police Forces，Shenyang110034，China;3.Department of Otorhinolaryngology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China

ObjectiveTo investigate the expression and role of interleukin－23(IL－23)in nasal polyp patients.Methods NP tissues of 15 nasal polyp(NP)patients and 15 simple deviations of normal inferior turbinate tissues of nasal septum patients were collected.mRNA and protein expression of IL－23 were detected by means of immunohistochemistry and RT－PCR.Results Immunohistochemistry staining demonstrated that there were far more IL－23 positive cells in NP patients than in normal controls.The average expression level of IL －23 protein in NP tissues(0.321 ±0.023)was significantly different(P ＜0.01)from that of normal inferior turbinate tissues(0.199±0.011).RT －PCR demonstrated that the average expression level of IL －23p19mRNA in NP tissues(0.676 ±0.077)was significantly different(P ＜0.01)from that in normal inferior turbinate tissues(0.212 ±0.015).Conclusions IL－23 may be involved in the chronic inflammation of NP.

interleukin－23;nasal polyp;immunohistochemistry;RT－PCR

丁國臣，男，1977年出生。碩士，主治醫(yī)師。主要從事耳鼻喉科臨床工作。

1.110034 沈陽，武警遼寧總隊醫(yī)院耳鼻喉科，2.110034沈陽，武警遼寧總隊衛(wèi)生處;3.110004 沈陽，中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院耳鼻咽喉科

(2012－01－06收稿 2012－07－19修回)

(責(zé)任編輯 尤偉杰)