孫 超，郭 斐

鼠李糖脂是一種無毒且應(yīng)用廣泛的生物表面活性劑，具有乳化、起泡、殺菌、驅(qū)油等性能，同時可作為食品添加劑的表面活性劑，有著廣泛的應(yīng)用前景。鼠李糖脂在石油工業(yè)中主要應(yīng)用于三次采油和石油污染土壤修復(fù);在農(nóng)業(yè)中主要應(yīng)用于土壤性能的改良，保護植物以及作無污染殺菌劑使用;在環(huán)境修復(fù)中主要應(yīng)用于修復(fù)重金屬污染，實驗證明鼠李糖脂對土壤中多種重金屬離子的洗脫能力強于普通的化學表面活性劑。

我們分離篩選出的銅綠假單胞菌NY3［1］能利用不同碳源和氮源發(fā)酵產(chǎn)鼠李糖脂。通過改變培養(yǎng)基中的碳源和氮源，利用NY3菌發(fā)酵產(chǎn)生出結(jié)構(gòu)性能不同的鼠李糖脂，為有目的控制NY3菌株發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

銅綠假單胞菌NY3，本實驗室分離鑒定［2］。

1.1.2 培養(yǎng)基

NY3種子液培養(yǎng)基:牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，pH=7.0～7.2，蒸餾水定容至1 000 ml，121℃高壓蒸汽滅菌30 min。

無機鹽培養(yǎng)基:NH4NO31.004 g(或含氮量相當?shù)谋?中所列出的其他氮源)，磷酸鹽緩沖液30 mL (K2HPO442 g，NaH2PO428 g，pH7.5，蒸餾水定容至1 000 ml)，MgSO4溶液0.5 mL(24.64 g/L)，CaCl2溶液0.1 mL(CaCl2·2H2O 14.72 g/L)，微量元素1.5 mL(FeSO4·7H2O 4.5 g/L、ZnSO4·7H2O 0.148 g/L、MnSO4·4H2O 0.3 g/L、CoCl2·6H2O 0.024 g/L、NiCl2·6H2O 0.024 g/L、CuCl2·6H2O 0.017 g/L、Na2MoO4·2H2O 0.109 g/L、H3BO30.062 g/L)，置于1L容量瓶中，調(diào)節(jié)pH為9.0，蒸餾水定容至刻度。

鼠李糖脂發(fā)酵培養(yǎng)基:100 ml無機鹽培養(yǎng)基，加入5 ml菜籽油(或重量百分比為4.8%的表1中列出的其他碳源)，121℃高壓蒸汽滅菌30 min。

1.2 鼠李糖脂的發(fā)酵和提純

將NY3菌接種于100 ml NY3種子液培養(yǎng)基，置30℃搖床(170 r/min)好氧培養(yǎng)24 h，得NY3種子液。以1%接種量將其接種于100 ml鼠李糖脂培養(yǎng)基中，于30℃搖床(170 r/min)好氧培養(yǎng)72h，得含鼠李糖脂發(fā)酵液。再于10 000 r/min轉(zhuǎn)速、4℃離心10 min。用濃HCl調(diào)上清液pH=2，靜置4℃冰箱中過夜，即得發(fā)酵液。收集離心沉淀，在pH=2條件下洗滌沉淀，用1 mol/L的NaOH溶解，調(diào)pH= 7，冷凍干燥得到微生物表面活性劑粗品，用CH2Cl2抽提后減壓蒸干，溶于0.01 mol/L的NaOH溶液，再用Whatman No.4濾紙過濾，調(diào)濾液pH=2，于10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心30 min，收集沉淀，真空干燥，即得鼠李糖脂純品［3］。

1.3 分析方法

1.3.1 發(fā)酵液性能分析方法

pH值測定:用pHS-3C酸度計測定。

排油圈直徑測定:取直徑10 cm培養(yǎng)皿一個，加20 ml水后，在中心加0.5 ml橄欖油，在油膜中心加0.1 ml發(fā)酵液，中心油膜被擠向四周形成一個圓，其直徑與表面活性劑的含量和活性成正比，測量排油圈直徑大小。

乳化性能測定:取10 ml刻度比色管，加5 ml航空煤油和5 ml發(fā)酵液，搖動混合30 s，靜置數(shù)分鐘，重復(fù)三次，讀取乳化層體積并觀察其穩(wěn)定性。

表面張力測定:使用最大氣泡法進行測量。

1.3.2 鼠李糖脂性能分析方法

含糖量測定:蒽酮 -硫酸法［4］，在試管中加0.2%的蒽酮-濃硫酸4 mL為顯色劑，沿試管壁滴加樣品1 mL，冷卻后沸水浴加熱20 min，于30 min內(nèi)在553 nm處測定OD值。

紅外光譜測定:將提純的鼠李糖脂與KBr粉末壓片，放入紅外光譜儀中掃描，得到紅外光譜圖。

不飽和鍵含量測定:利用碘量法［5］進行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 碳源對NY3菌發(fā)酵產(chǎn)表面活性劑特性的影響

大量實驗表明［1］，NY3菌能利用多種碳源發(fā)酵產(chǎn)鼠李糖脂。以硝酸銨為氮源，按照1.2中的實驗方法制得發(fā)酵液和鼠李糖脂后以1.3的分析方法測定其各項性能，結(jié)果如表1所示。

表1 不同碳源制得發(fā)酵液和鼠李糖脂性能測定結(jié)果

表1結(jié)果表明，發(fā)酵碳源不同，發(fā)酵液的性能有較大差別。以菜籽油和橄欖油為碳源時，發(fā)酵液具有極好的排油和乳化性能，且其表面張力分別降到25.92、25.49 mN/m，純鼠李糖脂含糖量分別為15.38%、12.24%，相對較低。而以丙三醇和葡萄糖為碳源時，NY3發(fā)酵液具有較好的排油性能和較差的乳化性能，發(fā)酵液的表面張力分別降到27.33、 30.17 mN/m，純鼠李糖脂含糖量達到28.62%、23.22%，這說明它們具有更好的水溶性。

按照1.3.2的分析方法測定純化后鼠李糖脂的紅外光譜，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同碳源NY3發(fā)酵產(chǎn)的鼠李糖脂紅外光譜

圖1中3 437 cm-1吸收帶由鼠李糖環(huán)上OH的伸縮振動吸收引起;2 920 cm-1、2 850 cm-1是由脂鏈中甲基和亞甲基C-H對稱與不對稱伸縮振動產(chǎn)生的吸收峰;1 750 cm-1為 C=O吸收帶，1 055 cm-1為C-O-C伸縮振動吸收帶，說明分子中有五圓環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)和糖苷鍵存在;3 007 cm-1處有一明顯小峰，應(yīng)為不飽和雙鍵C=C吸收峰，說明分子中有不飽和鍵。按照前期有關(guān)NY3發(fā)酵產(chǎn)表面活性劑的研究結(jié)果［1］和圖1中的紅外譜圖結(jié)果，NY3菌用不同碳源發(fā)酵所產(chǎn)表面活性劑為鼠李糖脂類化合物?？捎? 437 cm-1峰面積和2 920 cm-1～2 850 cm-1處面積比衡量鼠李糖脂中糖含量，該比值越大，糖含量相對越高。利用Origin8軟件計算該比值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菜籽油、丙三醇、橄欖油、葡萄糖分別為碳源時，該比值為 1.322、18.778、0.706、6.528，因此，丙三醇為碳源所產(chǎn)鼠李糖脂糖含量最高，橄欖油為碳源所產(chǎn)鼠李糖脂糖含量最低。鼠李糖脂含糖量高其水溶性好，含糖量小則排油效果好，因此，紅外光譜測定結(jié)果和發(fā)酵液性能測定結(jié)果是一致的。

2.2 氮源對NY3菌發(fā)酵產(chǎn)表面活性劑特性的影響

以菜籽油為碳源，NY3在不同氮源條件下生產(chǎn)的鼠李糖脂也具有不同的特性和結(jié)構(gòu)，試驗選取了4種具有代表性的氮源，為降低加入種子液給發(fā)酵液帶來的影響，接種量減小為0.5%，氮源的量增大到原來的1.5倍，其測定結(jié)果如表2。

表2 不同氮源制得發(fā)酵液和鼠李糖脂性能測定結(jié)果

表2結(jié)果表明，硝酸銨和硝酸鈉為氮源時，NY3發(fā)酵液有極好的排油和乳化性能，表面張力降到25.92、24.64 mN/m，純鼠李糖脂含糖量為15.38%、17.16%;而以氯化銨為氮源時，NY3發(fā)酵液的排油性能和乳化性能很差，表面張力為66.93 mN/m，接近蒸餾水的，純鼠李糖脂含糖量為10.77%;蛋白胨為氮源時，NY3發(fā)酵液有較好的排油和乳化性能，發(fā)酵液的表面張力為27.07 mN/m，純鼠李糖脂含糖量為15.26%。

按照1.3.2的分析方法，測定純化后鼠李糖脂的紅外光譜(圖2)。

圖2 不同氮源NY3發(fā)酵產(chǎn)的鼠李糖脂紅外光譜

如圖2所示，NY3在4種不同氮源培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)鼠李糖脂的吸收峰都相同或是有少許移位，總體差異并不大，因此，仍為鼠李糖脂類。較為明顯的差別為羥基的吸收峰和C=C的吸收峰，其中氮源為硝酸鹽時，沒有出現(xiàn)明顯的不飽和鍵(包括硝酸鉀等)，而有銨鹽、硝酸銨、蛋白胨等為氮源時，不飽和鍵就會很明顯。

用3 437 cm-1峰面積和 2 920 cm-1～2 850 cm-1處面積比衡量鼠李糖脂含糖量。硝酸銨、硝酸鈉、氯化銨、蛋白胨為氮源時，該比值分別為1.322、1.471、0.519、0.534。因此，氮源對NY3產(chǎn)鼠李糖脂含糖量影響不大。氮源為氯化銨生產(chǎn)的鼠李糖脂含糖量最低，為10.77%，且具有破乳性能。氨氮為氮源產(chǎn)鼠李糖脂含不飽和鍵，有抗氧化性。按照1.3中的碘量法測定4種氮源所產(chǎn)鼠李糖脂的不飽和鍵含 量，分別為 14.02、0、10.93、13.64 mmol/g。

3 結(jié)論

銅綠假單胞菌NY3能利用多種碳源和氮源發(fā)酵產(chǎn)鼠李糖脂，且碳源、氮源不同，鼠李糖脂化學組成和產(chǎn)量有明顯的差別，使得發(fā)酵液的乳化、排油等性能及其表面張力有較大差異。通過研究獲得以下結(jié)論:

(1)菜籽油和橄欖油為碳源，所產(chǎn)鼠李糖脂含糖量低，發(fā)酵液有好的排油性能，且表面張力較低;丙三醇和葡萄糖為碳源，所產(chǎn)鼠李糖脂含糖量高，其水溶性好;菜籽油、橄欖油、丙三醇、葡萄糖為碳源得鼠李糖脂產(chǎn)量分別為 12.78、5.19、14.02、2.08 g/L。

(2)硝酸銨和硝酸鈉為氮源，NY3發(fā)酵液有極好的排油和乳化性能，表面張力下降顯著，提純的鼠李糖脂含糖量為15.38%、17.16%;氯化銨為氮源，NY3發(fā)酵液的排油性能和乳化性能很差，表面張力接近蒸餾水的，提純的鼠李糖脂含糖量較低;蛋白胨為氮源，NY3發(fā)酵液具有較好的排油和乳化性能，表面張力降到27.07 mN/m，提純的鼠李糖脂含糖量為15.26%。硝酸銨、硝酸鈉、氯化銨、蛋白胨為氮源得鼠李糖脂產(chǎn)量分別為12.75、12.36、2.65、9.48 g/L。

(3)氨氮為氮源產(chǎn)鼠李糖脂含不飽和鍵，有抗氧化性。硝酸銨、氯化銨、蛋白胨為氮源時，不飽和鍵含量為14.02、10.93、13.64 mmol/g。

［1］劉超.銅綠假單胞菌NY3產(chǎn)表面活性劑發(fā)酵條件優(yōu)化及表面活性劑性能研究［D］.陜西:西安建筑科技大學，2011.

［2］惠艷.優(yōu)良菌種降解烴類污染物相互作用關(guān)系研究［D］.陜西，西安建筑科技大學，2009.

［3］馬滿英，施周，劉有勢等.預(yù)處理酸沉淀冷凍干燥法提取鼠李糖脂新工藝［J］，湖南大學學報，2008，35(1):75-78.

［4］盧國滿，劉紅玉等.鼠李糖快速分析方法及其影響因素研究［J］，微生物學通報，2006，33(4):106-111.

［5］國家環(huán)境保護總局《空氣和廢氣監(jiān)測分析方法》編委會.空氣和廢氣監(jiān)測分析方法［M］.第四版增補版.北京:中國環(huán)境科學出版社，2008:421-422.