王詩路，趙國明，劉 輝，鄒慧斌，咸 漠

（1.中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所，山東 青島 266101；2.中國科學(xué)院研究生院，北京 100049）

固定化脂肪酶催化合成癸二酸二（2-乙基己基）酯

王詩路1,2，趙國明1，劉 輝1，鄒慧斌1，咸 漠1

（1.中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所，山東 青島 266101；2.中國科學(xué)院研究生院，北京 100049）

在有機(jī)溶劑中，分別采用固定化脂肪酶Lipozyme TL IM，Lipozyme RM IM和Novozym 435催化癸二酸和2-乙基己醇合成癸二酸二（2-乙基己基）酯，考察了溶劑、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、酶量和底物比等對產(chǎn)率的影響。結(jié)果表明：反應(yīng)溫度40 ℃，癸二酸400 mg，2-乙基己醇0.96 mL（2-乙基己醇和癸二酸物質(zhì)的量之比3），環(huán)己烷15 mL，在600 PLU固定化脂肪酶催化條件下反應(yīng)24 h，Lipozyme TL IM催化產(chǎn)率可達(dá)96.94%，Lipozyme RM IM催化產(chǎn)率可達(dá)96.23%，Novozym 435催化產(chǎn)率可達(dá)84.65%。在上述反應(yīng)條件下，使用6次后，這3種固定化脂肪酶仍保持較高的催化活性。

固定化脂肪酶 癸二酸二（2-乙基己基）酯 有機(jī)溶劑 環(huán)己烷

癸二酸二（2-乙基己基）酯是優(yōu)良的耐寒增塑劑，還可用作噴氣發(fā)動(dòng)機(jī)的潤滑油[1]。工業(yè)上，癸二酸二（2-乙基己基）酯是在減壓條件下通過硫酸催化癸二酸和2-乙基己醇酯化合成，但該法反應(yīng)選擇性差、副反應(yīng)多、產(chǎn)品色澤深, 對設(shè)備和管道腐蝕嚴(yán)重[2]。目前也有將雜多酸類催化劑應(yīng)用于酯化[3-5]，但由于雜多酸價(jià)格較高、比表面積較小、易溶于水等極性有機(jī)溶劑，因此需要將其負(fù)載到多孔固體載體上[6]。而固載后存在雜多酸的溶脫等問題[7]，導(dǎo)致其工業(yè)化應(yīng)用受到限制。與上述酸類酯化催化劑相比，固定化脂肪酶具有反應(yīng)條件溫和、性能穩(wěn)定、催化高效專一、便于回收等優(yōu)點(diǎn)，擁有良好的工業(yè)化應(yīng)用前景[8]。李偉等[9]在無溶劑體系中用固定化脂肪酶Novozym 435催化1,2-丙二醇和月桂酸酯化，酯化率可達(dá)91.89%，使用6次后，月桂酸酯化率仍可達(dá)70%以上。馬婭等[10]在有機(jī)溶劑中用固定化Candidasp 99-125催化己酸乙酯合成，己酸轉(zhuǎn)化率可達(dá)96%，脂肪酶使用3次后，己酸轉(zhuǎn)化率仍可達(dá)到75%以上。目前，國內(nèi)外關(guān)于酶法合成癸二酸二（2-乙基己基）酯的系統(tǒng)研究報(bào)道較少，因此本研究考察在有機(jī)溶劑體系中，固定化脂肪酶Lipozyme TL IM，Lipozyme RM IM和Novozym 435催化癸二酸二（2-乙基己基）酯合成的影響因素以及酶的重復(fù)使用性能，以期尋求較佳的催化工藝條件。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 固定化脂肪酶酶活測定

采用酯合成原理測固定化脂肪酶活性[11]。酶活單位為60 ℃條件下，每分鐘生成1毫摩爾丙基月桂酸脂所需的量為一個(gè)單位，用PLU表示。本實(shí)驗(yàn)所用的3種固定化脂肪酶均出自同一批次，各酶酶活均一。經(jīng)檢測，Lipozyme TL IM和Lipozyme RM IM酶活均是6 000 PLU/g，Novozym 435酶活是7 200 PLU/g。

1.2 癸二酸二（2-乙基己基）酯合成

稱取400 mg癸二酸和一定量2-乙基己醇于100 mL具塞錐形瓶中，加入適量的固定化脂肪酶（按照酶活計(jì)），再加入15 mL溶劑，置于轉(zhuǎn)速為150 r/min 的恒溫水浴振蕩器中反應(yīng)。一定時(shí)間后取出反應(yīng)溶液，與無水乙醇按照體積比60∶40混溶，過濾，之后測濾液總體積，低溫靜置保存。每組實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行樣，結(jié)果取其平均值。

1.3 癸二酸二（2-乙基己基）酯產(chǎn)率測定

采用Varian 450-GC氣相色譜儀分析上述濾液，采用Agilent CP-Wax 58 FFAP柱（25 m×0.25 mm×0.2 μm）毛細(xì)管氣相色譜柱以及FID檢測器。色譜分析條件：進(jìn)樣量1 μL，載氣N2，載氣流速2 mL/min，分流比50∶1，進(jìn)樣器溫度300 ℃，檢測器溫度320 ℃。柱溫程序：0～1 min，120 ℃；1～5.3 min，120～250 ℃，升溫速率30 ℃/min；5.3～13.3 min，250 ℃。采用外標(biāo)法計(jì)算癸二酸二（2-乙基己基）酯的含量。依據(jù)癸二酸二（2-乙基己基）酯標(biāo)準(zhǔn)品確定其保留時(shí)間是6.8 min。標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，濃度（X，單位mg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程Y=2 649.6X，其R2=0.998 4。根據(jù)回歸方程計(jì)算癸二酸二（2-乙基己基）酯產(chǎn)率。

2 結(jié)果與討論

2.1 溶劑的影響

有機(jī)溶劑性質(zhì)對于非水酶催化活性的影響，常用有機(jī)溶劑和水的分配系數(shù)（logP）表達(dá)溶劑性質(zhì)的參數(shù)，logP值越大，溶劑的疏水性越強(qiáng)；logP值越小，溶劑的親水性越強(qiáng)[12]。在40 ℃，癸二酸400 mg，2-乙基己醇0.96 mL（醇酸物質(zhì)的量之比3），溶劑15 mL，固定化脂肪酶600 PLU的條件下反應(yīng)24 h，考察反應(yīng)溶劑logP值對癸二酸二（2-乙基己基）酯產(chǎn)率的影響，結(jié)果見表1。Novozym 435的耐受有機(jī)溶劑極性范圍最廣，在所選的8種有機(jī)溶劑中，均可以催化生成癸二酸二（2-乙基己基）酯，其中最低產(chǎn)率為45.90%，最高產(chǎn)率為85.80%。Lipozyme TL IM 和Lipozyme RM IM耐受有機(jī)溶劑極性范圍不如Novozym 435，但是在logP為3.04～6.42的5種有機(jī)溶劑中，產(chǎn)率分別都高于相同溶劑中Novozym 435催化的產(chǎn)率?？傮w而言，隨著logP值逐漸增大，溶劑的疏水性增強(qiáng)，3種固定化脂肪酶催化癸二酸二（2-乙基己基）酯的產(chǎn)率均呈現(xiàn)先升后降的趨勢。具體來說，在logP為3.46～5.87的3種有機(jī)溶劑中，Lipozyme RM IM催化產(chǎn)率均在95%以上；在logP為3.46～4.17的2種有機(jī)溶劑中，Lipozyme TL IM催化產(chǎn)率均在96%以上，Novozym 435催化產(chǎn)率均在84%以上。由此可見，環(huán)己烷（logP為3.46）和正庚烷（logP為4.17）均適用于作為3種固定化脂肪酶的反應(yīng)溶劑。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，選擇環(huán)己烷作為反應(yīng)溶劑。

表1 反應(yīng)溶劑對癸二酸二（2-乙基己基）酯產(chǎn)率的影響Table 1 Effects of solvents on yield of bis(2-ethylhexyl) sebacate

2.2 反應(yīng)溫度的影響

癸二酸400 mg，2-乙基己醇0.96 mL（醇酸物質(zhì)的量之比3），環(huán)己烷15 mL，在600 PLU固定化脂肪酶催化條件下反應(yīng)24 h，考察反應(yīng)溫度對癸二酸二（2-乙基己基）酯產(chǎn)率的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可知:這3種固定化脂肪酶隨溫度的變化趨勢基本相同。反應(yīng)溫度為30 ℃時(shí)，產(chǎn)率為最低值。反應(yīng)溫度從30 ℃上升至40 ℃，產(chǎn)率升高；從40 ℃上升至60 ℃，產(chǎn)率呈下降趨勢；從60 ℃升至70 ℃，產(chǎn)率回升。產(chǎn)率隨溫度的非線性變化，可能是本合成反應(yīng)是非均相可逆的平行串聯(lián)反應(yīng)這一特性決定的。非均相可逆的平行串聯(lián)反應(yīng)屬于非常復(fù)雜的復(fù)合反應(yīng)，目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率和反應(yīng)條件參數(shù)并不一定呈線性變化。Lipozyme TL IM 和Lipozyme RM IM催化反應(yīng)的最高產(chǎn)率出現(xiàn)在40 ℃時(shí)，而Novozym 435催化反應(yīng)的最高產(chǎn)率出現(xiàn)在70 ℃時(shí)。基于高溫對酶具有破壞性影響和節(jié)省能源的考慮[13]，本實(shí)驗(yàn)適宜的反應(yīng)溫度為40 ℃。

圖1 反應(yīng)溫度對癸二酸二（2-乙基己基）酯產(chǎn)率的影響Fig.1 Effect of reaction temperature on yield of bis(2-ethylhexyl) sebacate

圖2 癸二酸二（2-乙基己基）酯產(chǎn)率隨時(shí)間的變化Fig.2 The change of bis(2-ethylhexyl) sebacate yield with reaction time

2.3 反應(yīng)隨時(shí)間的變化情況

反應(yīng)溫度40 ℃，癸二酸400 mg，2-乙基己醇0.96 mL（醇酸物質(zhì)的量之比3），環(huán)己烷15 mL，在600 PLU固定化脂肪酶催化條件下反應(yīng)，考察癸二酸二（2-乙基己基）酯產(chǎn)率隨時(shí)間的變化情況，結(jié)果見圖2。由圖2可知，這3種固定化脂肪酶隨時(shí)間變化的趨勢基本相同。反應(yīng)時(shí)間從0到12 h，產(chǎn)率呈近線性增長；從12 h到24 h，Lipozyme TL IM 和Lipozyme RM IM催化反應(yīng)的產(chǎn)率上升至最高值。因此，在此實(shí)驗(yàn)條件下，反應(yīng)24 h比較合適。Novozym 435催化反應(yīng)產(chǎn)率在24 h之后緩慢上升，從24 h到48 h，反應(yīng)時(shí)間增加一倍，產(chǎn)率僅增加約2%。綜合考慮，既要保持較高的反應(yīng)產(chǎn)率，又要維持適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)效率，Novozym 435催化反應(yīng)適宜的反應(yīng)時(shí)間為24 h較合適。

2.4 酶量的影響

反應(yīng)溫度40 ℃，癸二酸400 mg，2-乙基己醇0.96 mL（醇酸物質(zhì)的量之比3），環(huán)己烷15 mL，在固定化脂肪酶催化條件下反應(yīng)24 h，考察酶量對癸二酸二（2-乙基己基）酯產(chǎn)率的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知：酶量從0增加到600 PLU，產(chǎn)率均呈近線性增長趨勢；酶量從600增加到1 000 PLU，Lipozyme TL IM 和Lipozyme RM IM催化產(chǎn)率先略有下降，后趨于平穩(wěn)；Novozym 435催化產(chǎn)率先大幅下降，后快速回升。由于反應(yīng)體系內(nèi)的水含量相對比較穩(wěn)定，隨著酶量增加，分配到酶分子的水就會(huì)相對減少，導(dǎo)致酶活受到影響，從而使產(chǎn)率下降[14]。據(jù)推測，除了水含量會(huì)直接影響酶活外，Novozym 435的固定化載體（聚丙烯酸樹脂）對溶液微環(huán)境變化很敏感，結(jié)果導(dǎo)致Novozym 435催化產(chǎn)率隨著時(shí)間的推移呈現(xiàn)出更復(fù)雜的變化。當(dāng)酶量為600 PLU時(shí)，固定化脂肪酶的產(chǎn)率均最高。因此，在此實(shí)驗(yàn)條件下，合適的酶量為600 PLU。

圖3 酶量對癸二酸二（2-乙基己基）酯產(chǎn)率的影響Fig.3 Effects of lipase dosage on yield of bis(2-ethylhexyl) sebacate

圖4 2-乙基己醇和癸二酸物質(zhì)的量之比對癸二酸二（2-乙基己基）酯產(chǎn)率的影響Fig.4 Effects of molar ratio of 2-ethylhexanol to sebacic acid on yield of bis(2-ethylhexyl) sebacate

2.5 底物比的影響

反應(yīng)溫度40 ℃，癸二酸400 mg，一定量的2-乙基己醇，環(huán)己烷15 mL，在600 PLU固定化脂肪酶催化條件下反應(yīng)24 h，考察底物比對癸二酸二（2-乙基己基）酯產(chǎn)率的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知：Lipozyme RM IM和Novozym 435變化趨勢基本一致；當(dāng)2-乙基己醇和癸二酸物質(zhì)的量之比從2增加到3，這3種固定化脂肪酶催化產(chǎn)率均呈上升趨勢；2-乙基己醇和癸二酸物質(zhì)的量之比從3增加到4，Lipozyme RM IM和Novozym 435催化產(chǎn)率先降后升，Lipozyme TL IM催化產(chǎn)率則先是略微下降，之后維持在90%左右。當(dāng)2-乙基己醇和癸二酸物質(zhì)的量之比為3時(shí)，固定化脂肪酶的產(chǎn)率均為最高。因此，在此實(shí)驗(yàn)條件下，2-乙基己醇和癸二酸合適的物質(zhì)的量之比為3。

2.6 固定化脂肪酶的重復(fù)使用性

在反應(yīng)溫度40 ℃，癸二酸400 mg，2-乙基己醇0.96 mL（醇酸物質(zhì)的量之比3），環(huán)己烷15 mL，在600 PLU固定化脂肪酶催化條件下反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后取樣檢測，并將固定化酶晾干，以備下一批反應(yīng)時(shí)使用，結(jié)果見圖5。由圖5可知，除第1批反應(yīng)之后，3種固定化脂肪酶催化癸二酸二（2-乙基己基）酯產(chǎn)率有明顯下降之外，從第2批直到第6批，產(chǎn)率都維持在較穩(wěn)定水平。經(jīng)過多次重復(fù)使用，這3種固定化脂肪酶都能保持較高的催化活性，說明它們在本反應(yīng)體系中具有良好的穩(wěn)定性。

圖5 固定化脂肪酶的重復(fù)使用性Fig.5 Reusability of immobilized lipase

3 結(jié) 論

分別采用不同的固定化脂肪酶催化癸二酸二（2-乙基己基）酯合成，在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，均可以獲得較高的產(chǎn)率，其中采用Lipozyme TL IM和Lipozyme RM IM，最高產(chǎn)率可達(dá)96%以上，采用Novozym 435，催化產(chǎn)率可達(dá)84.65%。這3種固定化脂肪酶使用6次后，均能保持較高產(chǎn)率和較好的催化穩(wěn)定性。

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Synthesis of Bis(2-Ethylhexyl) Sebacate Catalyzed by Immobilized Lipase

Wang Shilu1,2, Zhao Guoming1, Liu Hui1, Zou Huibin1, Xian Mo1
（1. Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266101, China;2. Graduate University of Chinese Academy of Science, Beijing 100049, China）

Bis(2-ethylhexyl) sebacate was synthesized from sebacic acid and 2-ethylhexanol using different immobilized lipases, namely Lipozyme TL IM, Lipozyme RM IM and Novozym 435, in an organic solution. The effects of solvents, reaction temperature and time, lipase dosage to substrate ratio, on the product yield were investigated. The results showed that the favored synthesis conditions were: reaction temperature of 40 ℃,sebacic acid of 400 mg and 2-ethylhexanol of 0.96 mL (molar ratio of 2-ethylhexanol to sebacic acid was 3),cyclohexane of 15 mL, reaction time of 24 h with 600 PLU lipase. Under above synthesis conditions, the product yield was up to 96.94% with Lipozyme TL IM catalyst, 96.23% with Lipozyme RM IM catalyst, and 84.65%with Novozym 435 catalyst. Moreover, these three kinds of immobilized lipase still maintain high catalytic activities after being used 6 times.

immobilized lipase; bis(2-ethylhexyl) sebacate; organic solvent; cyclohexane

TQ645 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

1001—7631 ( 2012 ) 04—0330—05

2012-07-16；

2012-08-20

王詩路（1984—），女，博士研究生；咸漠（1967—），男，研究員，博士生導(dǎo)師，通訊聯(lián)系人。E-mail: xianmo@qibebt.ac.cn

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（21106170，21206185）；中國科學(xué)院創(chuàng)新促進(jìn)會(huì)首批會(huì)員專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)（Y11A031105）；山東省自然科學(xué)基金（ZR2011CQ049）