韋壽蓮，梁 慧,陳宏彬

（肇慶學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院,廣東 肇慶 526061）

8－OHdG是由活性氧自由基攻擊DNA分子中的鳥嘌呤堿基第8位碳原子而產(chǎn)生的一種氧化性化合物[1－2].由于DNA的氧化損傷與基因突變、細(xì)胞癌變及個(gè)體衰老等密切相關(guān)，因此研究DNA中8－OHdG的水平對(duì)評(píng)估機(jī)體氧化損傷的程度、衰老機(jī)制、癌發(fā)生機(jī)制均有重要意義.

目前,8－OHdG的分析方法主要有32P后標(biāo)記法[3]、高效液相色譜－電化學(xué)法[4]、氣相色譜－質(zhì)譜法[5]、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法[6]、毛細(xì)管電泳檢測(cè)法[7]、電化學(xué)法[8－10]等.這些方法各有優(yōu)勢(shì)與不足：如32P后標(biāo)記法操作復(fù)雜，易造成放射性污染；而毛細(xì)管電泳檢測(cè)法的靈敏度較低；電化學(xué)分析法則具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏等特點(diǎn).Brett等[8]直接采用玻碳電極檢測(cè)8－OHdG，檢出限達(dá)0.8 μmol/L.為提高檢測(cè)靈敏度，文獻(xiàn)[9－10]的作者分別以碳納米管分散到聚乙烯或直接以碳納米管修飾電極，獲得的檢出限分別達(dá)0.1 μmol/L和9 nmol/L，但修飾電極制備相對(duì)比較復(fù)雜.本文中，筆者采用電化學(xué)分析法對(duì)8－OHdG在玻碳電極上的電化學(xué)行為進(jìn)行研究.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)采用CHI 612A電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)；三電極系統(tǒng)：玻碳電極為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑絲為輔助電極；PXS－450型精密酸度計(jì).實(shí)驗(yàn)試劑如下：8－OHdG購(gòu)自sigma公司(St.Louis.Mo.USA)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭粚?shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液的配制

配制B－R緩沖液：準(zhǔn)確稱取硼酸4.946 4 g，于燒杯中分別加入冰醋酸4.6 mL和磷酸5.33 mL，用雙蒸水稀釋至1 000 mL，配成濃度為0.04 mol/L的三酸混合液.

Na2HPO4－NaH2PO4緩沖液(pH值為5.0)的制備：取一定量的磷酸二氫鈉溶液0.05 mol/L，用氫氧化鈉試液調(diào)節(jié)pH值至5.0，即得.

1.2.2 電極預(yù)處理

玻碳電極表面用納米級(jí)Al2O3粉末拋光至鏡面,用超純水洗滌干凈,晾干備用.

1.2.3 循環(huán)伏安法

取一定量的8－OHdG置于10 mL容量瓶中,加入支持電解質(zhì)的溶液至刻度，搖勻，移入電解池.采用三電極系統(tǒng),在0～＋1.5 V范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安掃描,考察其電化學(xué)特性.

1.2.4 恒電位庫(kù)侖電解法

在含7.06 μmol/L 8－OHdG的25 mL 50 mmol/L Na2HPO4－NaH2PO4緩沖液(pH值為5.0)中通N2除氧l h，在玻碳電極上于0.63 V處電解2 h，記錄法拉第電流I和持續(xù)時(shí)間；同時(shí)，在相同的條件下對(duì)底液進(jìn)行電解，記錄在該電位氧化所產(chǎn)生的連續(xù)法拉第電流，作為空白值予以扣除.

2 結(jié)果與討論

2.1 支持電解質(zhì)的選擇

分別考察8－OHdG在50mmol/L（pH值為5.0）的HAc－NaAc、HCI－NH4CI、檸檬酸－檸檬酸鈉、Na2HPO4－NaH2PO4及B－R等緩沖液中的循環(huán)伏安行為.結(jié)果發(fā)現(xiàn)8－OHdG在Na2HPO4－NaH2PO4緩沖液中的峰電流最大，峰形最佳，因此選擇Na2HPO4－NaH2PO4緩沖液為支持電解質(zhì).

圖1 8－OHdG的循環(huán)伏安圖（掃描速率100 mV/s）

2.2 8－OHdG的伏安特性

在含7.06 μmol/L 8－OHdG的50 mmol/L Na2HPO4－NaH2PO4緩沖液(pH值為5.0)中，在0～＋l.3 V范圍內(nèi)對(duì)8－OHdG進(jìn)行5次循環(huán)伏安掃描，結(jié)果見圖1.由圖1可知第1周掃描在約＋0.62 V處出現(xiàn)一個(gè)明顯的氧化峰，無還原峰.連續(xù)環(huán)掃2～5周后，氧化峰電流不斷降低，表明氧化過程生成的產(chǎn)物在電極表面有一定的吸附性.8－OHdG氧化峰電位隨掃描速率增大而逐漸正移，顯示出不可逆波的特征，說明8－OHdG在電極上的電化學(xué)氧化過程是不可逆的.

2.3 支持電解質(zhì)pH值對(duì)峰電流、峰電位的影響

考察50 mmol/L Na2HPO4－NaH2PO4緩沖液（pH值在2.0～7.0范圍內(nèi)）對(duì)7.06 μmol/L 8－OHdG峰電流、峰電位的影響.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，8－OHdG的氧化峰電流在pH值為5.0時(shí)達(dá)到最大且相對(duì)較穩(wěn)定，故選擇pH值為5.0的緩沖液.而8－羥基脫氧鳥苷的峰電位隨pH值的增加而負(fù)移（見圖2），并且二者呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（r＝0.995 3），其斜率為－0.054 5，可以推斷氫離子參與了電極反應(yīng)[11].

圖2 pH值對(duì)峰電位的影響（掃描速率100 mV/s）

2.4 8－OHdG體系的穩(wěn)定性

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，每隔一段時(shí)間對(duì)同一份8－OHdG溶液進(jìn)行CV測(cè)定.結(jié)果表明8－OHdG體系在室溫下至少可以穩(wěn)定7 h左右.

2.5 不可逆吸附體系有關(guān)參數(shù)的測(cè)定

2.5.1 恒電位庫(kù)侖法測(cè)定電極反應(yīng)電子轉(zhuǎn)移數(shù)n

按1.2.4中的步驟電解溶液，根據(jù)公式n＝ΔQ/(FCV)求出電極反應(yīng)電子數(shù)n.式中ΔQ是扣除了底液在相同條件下電解所消耗的電荷量后，電解8－OHdG所需要的凈電荷量，F(xiàn)為Faraday常數(shù)(96 487 C/mol)，C為電解液中8－OHdG的濃度，V為陽極池中電解液的體積，結(jié)果見表1.平行進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，測(cè)得n＝5.8≈6.

表1 恒電位庫(kù)侖電解8－OHdG的結(jié)果

2.5.2 動(dòng)力學(xué)參數(shù)an

由線性掃描實(shí)驗(yàn)可得，當(dāng)8－OHdG濃度為7.06 μmol/L時(shí)，峰電流與掃描速率的平方根形成良好的線性關(guān)系，Ip＝－0.195 9＋0.112 57 ν1/2(r＝0.993 03)，表明8－OHdG的氧化過程受擴(kuò)散控制.而峰電位則與掃描速率的對(duì)數(shù)形成良好的線性關(guān)系，線性方程為Ep＝0.005 9 ln v＋0.531 9(r＝0.997 4)，根據(jù)Ep＝E＋(RT/anF) ln v[12]，求得an＝4.35(25℃).

2.5.3 電極反應(yīng)質(zhì)子轉(zhuǎn)移數(shù)

由圖2可知，峰電位Ep隨pH值增加而負(fù)移，表明有質(zhì)子參與電極反應(yīng)，且8－OHdG的峰電位Ep與pH值成良好的線性關(guān)系，線性方程為Ep＝0.794 4－0.05 45 pH，r＝0.995 3.由Nernst方程式知，Ep與pH值有如下關(guān)系式：Ep＝K－(0.059m/an)pH，式中m為質(zhì)子轉(zhuǎn)移數(shù)，因an＝4.35，因此質(zhì)子轉(zhuǎn)移數(shù)m＝4.

2.6 電極反應(yīng)機(jī)理的推測(cè)

由電極反應(yīng)電子轉(zhuǎn)移數(shù)和質(zhì)子轉(zhuǎn)移數(shù)，推測(cè)8－OHdG在玻碳電極表面的電極反應(yīng)機(jī)理為

3 小結(jié)

本文采用循環(huán)伏安法和恒電位庫(kù)侖電解法研究8－OHdG的電化學(xué)氧化特性，并計(jì)算出了不可逆吸附體系的有關(guān)參數(shù)，結(jié)果表明8－OHdG在玻碳電極表面進(jìn)行的是6電子4質(zhì)子的不可逆氧化反應(yīng).

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