邱素芳 陳巖松 陳 燕 潘建基

近年來，RT-PCR方法被廣泛應(yīng)用于各種腫瘤微轉(zhuǎn)移的檢測(cè)，在肺癌微轉(zhuǎn)移檢測(cè)中，常用的上皮特異性標(biāo)志物由于假陽性的存在而使其應(yīng)用受到限制，目前仍缺乏公認(rèn)的分子標(biāo)志物[1，2]。Iwao等[3]采用mRNA差異顯示技術(shù)篩選克隆了1個(gè)人類肺組織特異性基因lunx，試驗(yàn)表明lunx在所有正常肺組織及非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)組織中特異表達(dá)，而在其他人類腫瘤及正常組織中極少表達(dá)或不表達(dá),且lunx在正常間葉組織中不表達(dá)。因此，lunx可望成為肺癌微轉(zhuǎn)移檢測(cè)的特異分子標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)以lunx為靶基因采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測(cè)了肺癌患者外周血的lunx mRNA，以檢驗(yàn)其作為肺癌微轉(zhuǎn)移分子標(biāo)志物的可行性。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

福建省腫瘤醫(yī)院2007年6月～2008年12月確診為非小細(xì)胞肺癌患者共50例，男性30例，女性20例，年齡45～67歲，治療前抽取外周血行FQ-RT-PCR檢測(cè)lunx mRNA；對(duì)照組為同期我院胸外科住院的良性肺疾病患者(肺大泡、肺結(jié)核球、炎性假瘤)20例，男性12例，女性8例，年齡35～65歲；健康體檢者30例，男性15例，女性15例，年齡35～65歲。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

主要實(shí)驗(yàn)材料：淋巴細(xì)胞分離液購自中科院血液病研究所，Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR試劑盒由中山大學(xué)達(dá)安基因診斷中心提供。主要儀器：美國ABI7300擴(kuò)增儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)本采集與處理 各入組病例及對(duì)照均按標(biāo)準(zhǔn)操作程序抽取靜脈血5 ml，置于EDTA-K2抗凝管中，(為避免上皮細(xì)胞污染，所有標(biāo)本均采集2管，以第2管血為分析樣本)，于抽血完成后2 h內(nèi)用淋巴細(xì)胞分離液分離各標(biāo)本中單個(gè)核細(xì)胞，于-80℃冰箱中保存，待行進(jìn)一步的總RNA的提取。

1.3.2 引物、探針設(shè)計(jì)與合成 采用固相亞磷酰胺合成法合成引物與探針，實(shí)驗(yàn)方法采用巢式 FQ-RT-PCR法，目的基因Lunx:外側(cè)引物(F)5'-AGTGATTCCTGGCCTGAACAAC-3';外側(cè)引物(R)5'-CCTCTCCTGCTTATCTCTCACAGC-3'。內(nèi)側(cè)引物(F)5'-CCTGATGGCCACCGTCTCT-3';內(nèi)側(cè)引物(R)5'-GGGCGTATTCACTTGGAGCTT-3' 。巢式PCR第2輪擴(kuò)張片段長度為63 bp。探針：5'-FAM-TGTCACCATCCCTCTCGGCA-TAMRA-3' 。以上引物和探針由中山大學(xué)達(dá)安基因診斷中心提供設(shè)計(jì)與合成。

1.3.3 RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄 采用Trizol試劑溶解細(xì)胞，硫氰雙胍、酚、氯仿一步法提取待測(cè)樣本總RNA。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA量，A260/A280介于1.7～2.0之間，1%瓊脂糖凝膠電泳觀察RNA的完整性，EB染色可見28 s、18 s條帶。

1.3.4 cDNA的合成 按照試劑盒說明書進(jìn)行。將提取的RNA樣本進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)體系如下：5X逆轉(zhuǎn)錄Buffer 4 μl,10P下游引物(外)R 0.4 μl,dNTPs 0.5 μl,逆轉(zhuǎn)錄酶(MMLV) 1 μl，DEPC水 10.1 μl，RNA模板 4 μl，總體積20 μl。反應(yīng)條件：37℃ 1 h，然后95℃ 3 min。得到的cDNA產(chǎn)物于-20℃保存。

1.3.5 巢式PCR第1輪擴(kuò)增 取5 μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得的cDNA模板，按以下反應(yīng)體系進(jìn)行第1輪的PCR擴(kuò)增。5X定性PCR Buffer 10 μl,10P上游引物(外)(F) 1 μl,10P下游引物(外)(R) 1 μl,dNTPs 1 μl,Taq酶1 μl，DEPC水 31 μl，cDNA模板 5 μl，總體積50 μl。反應(yīng)條件：93℃ 5 min；然后93℃ 30 s，55℃ 45s，72℃ 45 s，共40循環(huán)；最后72℃ 7 min。

1.3.6 巢式PCR第2輪擴(kuò)增 取5 μl第1輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，按以下反應(yīng)體系進(jìn)行第2輪的PCR擴(kuò)增。5X定量PCR Buffer 10 μl,10P上游引物(內(nèi))(F) 1 μl,10P下游引物(內(nèi))(R) 1 μl,探針probe 1 μl,dNTPs 1 μl,Taq酶1 μl，DEPC水 30 μl，模板 5 μl，總體積50 μl。反應(yīng)條件：93℃ 2 min；然后93℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，共40循環(huán)；在每次PCR擴(kuò)增的延伸階段由擴(kuò)增儀自動(dòng)進(jìn)行熒光信號(hào)的收集及檢測(cè)。

1.3.7 陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備及擴(kuò)增 Lunx 基因陽性標(biāo)準(zhǔn)品由中山大學(xué)達(dá)安基因診斷中心構(gòu)建及定量賦值，濃度為5.3×1012/ml。將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成系列梯度，方法如下：取1 μl加水999 μl充分混勻作1000倍稀釋，再取5 μl按10倍依次稀釋為108、107、106、105、104。在對(duì)樣本進(jìn)行第2輪PCR擴(kuò)增的同時(shí),取107、106、105、1044個(gè)梯度標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行PCR擴(kuò)增,條件與1.3.6一致。

1.4 結(jié)果判定

待分析樣本是否為陽性通過擴(kuò)增曲線判定,典型的擴(kuò)增曲線應(yīng)為“S”型。擴(kuò)增儀根據(jù)系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品的熒光信號(hào)值與循環(huán)數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣本Lunx mRNA進(jìn)行定值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。χ2檢驗(yàn)及Fisher確切概率法，以P<0.05為具有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 Lunx mRNA標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線

擴(kuò)增曲線呈典型的“S”型，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)性良好，見圖1、圖2。檢測(cè)靈敏度為1000拷貝數(shù)/毫升。

圖1 Lunx mRNA標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線

圖2 Lunx mRNA標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 非小細(xì)胞肺癌患者組與各對(duì)照組Lunx mRNA的檢測(cè)結(jié)果

結(jié)果顯示，NSCLC組Lunx mRNA中位拷貝數(shù)(表1)為31 000 copies/ml,陽性率為56%，2個(gè)對(duì)照組中位拷貝數(shù)及陽性率均為0,NSCLC組與2個(gè)對(duì)照組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表1 肺癌患者及對(duì)照組lunx mRNA檢測(cè)結(jié)果

2.3 NSCLC組外周血Lunx mRNA的表達(dá)情況與臨床病理特征的關(guān)系

NSCLC組外周血Lunx mRNA的檢測(cè)結(jié)果與年齡、性別、病理類型無明顯關(guān)系(P<0.05)；與臨床分期有密切關(guān)系，中位拷貝數(shù)及陽性率隨腫瘤臨床分期的增加而升高(表2)。

表2 Lunx mRNA表達(dá)與NSCLC各項(xiàng)臨床因素相關(guān)性分析

3 討論

腫瘤微轉(zhuǎn)移是指惡性腫瘤發(fā)展過程中，播散并存在于血液循環(huán)、淋巴道、骨髓及各組織器官中的腫瘤細(xì)胞，但尚未形成轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)，且無任何臨床表現(xiàn)，常規(guī)病理學(xué)、影像學(xué)等方法難以發(fā)現(xiàn)和檢測(cè)到的轉(zhuǎn)移，是判斷復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和預(yù)后的重要指標(biāo)[4]。

近30年來，盡管隨著外科技術(shù)的發(fā)展，放療技術(shù)的改進(jìn)，化療新藥的應(yīng)用以及基因，生物治療技術(shù)的開展，肺癌的綜合治療達(dá)到了1個(gè)新的水平。但到目前為止，肺癌患者的預(yù)后仍沒有明顯改善，即便是認(rèn)為可完全切除的Ⅰ～Ⅲa期患者，5年生存率仍在30%～40% ，肺癌患者的預(yù)后與癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。絕大多數(shù)患者最終死于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[5～7]。統(tǒng)計(jì)表明，大約40.0%的肺癌患者就診時(shí)已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。肺癌轉(zhuǎn)移常通過血液和淋巴循環(huán)，癌細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)是轉(zhuǎn)移發(fā)生的早期。因此。循環(huán)中檢測(cè)出癌細(xì)胞在一定程度上表明腫瘤具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)移傾向，這無疑將有助于臨床腫瘤的分期和治療方案的選擇。

目前用于檢測(cè)NSCLC微轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物主要分為組織特異性標(biāo)志物和腫瘤特異性標(biāo)志物，前者如人肺組織特異性標(biāo)志物，后者如癌胚抗原等。人肺組織特異性標(biāo)志物L(fēng)unx是Iwao[3]等通過mRNA差異顯示技術(shù)分離的1個(gè)基因，它編碼含257個(gè)氨基酸，分子量為26.7 kDa的蛋白質(zhì)。Iwao等[3]用lunx mRNA RT-PCR法檢測(cè)了NSCLC患者手術(shù)切除淋巴結(jié)的微轉(zhuǎn)移，結(jié)果表明該方法具有很高的敏感性和特異性。2003年Mitas等[8]用PCR法檢測(cè)肺癌患者外周血，結(jié)果41.7%(10/24)為陽性，認(rèn)為Lunx是1種特異性好、敏感度高的腫瘤標(biāo)志物。

以TaqMan熒光標(biāo)記探針為基礎(chǔ)的FQ-PCR技術(shù)是在常規(guī)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上運(yùn)用熒光能量傳遞(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)技術(shù)，加入熒光標(biāo)記探針，即在其5’端標(biāo)記6-羧基熒光素(FAM)和在3’端標(biāo)記6-羧基-四甲基羅丹明(TAMRA)，將核酸擴(kuò)增、雜交、光譜分析和實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)結(jié)合起來，利用熒光信號(hào)來檢測(cè)PCR產(chǎn)物，是目前應(yīng)用較為廣泛的基因定量檢測(cè)方法[9]。巢式PCR是針對(duì)同一靶核酸設(shè)計(jì)一對(duì)外引物和一對(duì)內(nèi)引物，先用外引物進(jìn)行擴(kuò)增，再用內(nèi)引物擴(kuò)增，提高了PCR檢測(cè)的敏感性。

本研究采用巢式FQ-RT-PCR技術(shù)，通過檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌組、肺良性疾病組和健康對(duì)照組外周血的Lunx mRNA的表達(dá)及分析非小細(xì)胞肺癌疾病組Lunx mRNA的表達(dá)與各臨床特征的關(guān)系，研究Lunx mRNA作為NSCLC微轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物的可行性。結(jié)果顯示非小細(xì)胞肺癌患者組Lunx mRNA檢測(cè)陽性率為56%，NSCLC組與2個(gè)對(duì)照組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與文獻(xiàn)相符[10～14]。同時(shí)，lunx mRNA的表達(dá)與肺癌的分期明顯相關(guān)，與年齡、性別、病理分型等無明顯相關(guān)，與文獻(xiàn)相符[13,14]。以上結(jié)果提示肺癌患者外周血中l(wèi)unx mRNA的表達(dá)來自于轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞，而在肺良性疾病和健康人外周血、淋巴結(jié)中均未檢測(cè)到lunx mRNA的表達(dá)，表明lunx mRNA作為肺癌轉(zhuǎn)移檢測(cè)分子標(biāo)志物具有很好的特異性和敏感性。以上研究提示lunx mRNA是肺癌微轉(zhuǎn)移檢測(cè)敏感特異的分子標(biāo)志物，而微轉(zhuǎn)移的檢出表明腫瘤具有很高的轉(zhuǎn)移傾向，對(duì)臨床分期、判斷預(yù)后和確定手術(shù)及術(shù)后治療起到指導(dǎo)作用。血液、淋巴結(jié)中檢測(cè)到少量癌細(xì)胞并非最終一定形成顯性轉(zhuǎn)移，癌細(xì)胞自身生物學(xué)特性、機(jī)體免疫狀況、局部微環(huán)境都是重要的影響因素。通過隨訪，以進(jìn)一步明確微轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系。

[1]Osaki T,Oyama T,Gu CD,et al.Prognostic impact of micrometastatic tumor cells in the lymph nodes and bone marrow of patients with completely resected stage I non--small- cell lung cancer〔J〕.J Clin Oncol，2002，20(13)：2930.

[2]劉德林，朱廣迎，王 緒.肺癌微轉(zhuǎn)移的檢測(cè)及臨床意義〔J〕.中國肺癌雜志，2001，4(2)：121.

[3]Iwao K，Watanabe T，F(xiàn)ujiwara Y，et al.Isolation of a novel human lung specific gene，Lunx，a potential molecular marker for detection of micrometastasis in non small cell lung cancer〔J〕.Int J Cancer，2001，91(2)：433.

[4]Giamieri E，Dc Francersco GP，Carico E，et al.Detection，characterization and clinical significance of circulating cancer cells in patients surgically treated for breast cancer〔J〕.Chic，2004，25(5)：194.

[5]顧 科，張軍寧.非小細(xì)胞肺癌微轉(zhuǎn)移研究現(xiàn)狀〔J〕.實(shí)用癌癥雜志,2005,20(4)：437.

[6]公雪慧，鄔 蒙.非小細(xì)胞肺癌微轉(zhuǎn)移檢測(cè)及其臨床意義〔J〕.實(shí)用癌癥雜志,2005,20(5)：553.

[7]吳一龍.肺癌多學(xué)科綜合治療的理論基礎(chǔ)〔M〕.北京：人民衛(wèi)生出版社，2000：1～17.

[8]Mitas M，Hoover L，Silvestrl G，et al.Lunx is a superior molecular marker for detection of non-small cell lung cancer in peripheral blood〔J〕.J Mol Diagn，2003，5(4)：237.

[9]李金明.實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)〔M〕.北京：人民軍醫(yī)出版社，2007：17.

[10]吳 昊,李 滸,章希賢.非小細(xì)胞肺癌患者外周血和骨髓中Lunx基因表達(dá)的臨床意義〔J〕.中國腫瘤,2006,15(5):329.

[11]宋 萍,李 堅(jiān),殷凱生.檢測(cè)外周血Lunx mRNA表達(dá)對(duì)于診斷肺癌微轉(zhuǎn)移的臨床價(jià)值〔J〕.江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2006，16(4):304.

[12]朱廣迎，劉德林，王 緒.等.lunx mRNA RT-PCR 檢測(cè)肺癌的微轉(zhuǎn)移〔J〕.中國腫瘤臨床，2003，30(2)：124.

[13]劉 靜，榮 福.NSCLC外周血、區(qū)域淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移檢測(cè)對(duì)術(shù)前分期的臨床價(jià)值〔J〕.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2010，3 ：491.

[14]劉宏偉，謝 風(fēng)，劉 剛.等.RT-PCR法檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者外周血 Lunx mRNA的表達(dá)及臨床意義〔J〕.中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2008,12(8)：905.