錢秋海， 郭春芳， 錢衛(wèi)斌， 蔡欣蕊， 姜群群， 張新穎

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科， 山東 濟(jì)南 250011； 2.山東省禹城市人民醫(yī)院， 山東 禹城 251200；3.山東中醫(yī)藥大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院， 山東 濟(jì)南 250014)

糖尿病脂肪肝以糖尿病和肝臟結(jié)構(gòu)異常并存為主要臨床特征，是嚴(yán)重影響糖尿病患者身體健康的常見病。近年來，隨著糖尿病發(fā)病率的急劇增高，糖尿病脂肪肝的發(fā)病率顯著增高。糖尿病脂肪肝一旦發(fā)生，既可出現(xiàn)肝臟脂肪沉積、肝功能異常，又會(huì)增加胰島素抵抗，使糖尿病更難控制。肥胖抑制素(Obestatin)是2005年從大鼠胃組織中分離的一種Ghrelin相關(guān)肽，因其與肥胖、胃腸動(dòng)力疾病、糖尿病可能存在密切關(guān)系，已成為研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)以O(shè)bestatin為切入點(diǎn)，觀察糖肝康對(duì)糖尿病脂肪肝模型大鼠肝臟組織中Obestatin mRNA表達(dá)的影響并分析，報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物及飼料 健康雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量(200±20)g，由山東中醫(yī)藥大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXR(魯)2005015。常規(guī)飼料由山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。高糖高脂飼料(清潔級(jí))由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供(配方：10.0%豬油，20.0%蔗糖，10.0%蛋黃粉，0.5%膽酸鈉和59.5%常規(guī)飼料。)

1.2 藥品及試劑

1.2.1 觀察用藥 糖肝康(生黃芪、白術(shù)、茵陳、黃芩、柴胡、炒梔子、丹參、大黃等)：山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥房提供，實(shí)驗(yàn)時(shí)制成糖肝康濃縮煎劑，濃度為1.87 g/mL及3.75 g/mL。

1.2.2 對(duì)照用藥 降糖甲片，吉林敖東制藥有限公司提供，生產(chǎn)批號(hào)：090314。給藥時(shí)配成降糖甲混懸液，濃度約5.6 g/mL。

1.2.3 動(dòng)物模型用藥 鏈脲佐菌素(Streptozocin，STZ)：美國Sigma公司生產(chǎn)，北京博愛港商貿(mào)有限公司提供。

1.2.4 RT-PCR所用試劑 超純總RNA提取試劑盒，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；ReverTra Ace qPCR RT kit，Transgene PCR Mix，日本TOYOBO公司；15DL2000 DNA marker，日本TAKARA公司；氯仿分析純，異丙醇，無水乙醇，無RNAase 水等。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 eppendoff 普通高速離心機(jī)(5415D型，Centrifuge公司)；PCR儀(PTC-200 Peltier Thermal Cycler，美國PE公司)；Alpha Imager TM 2200 凝膠成像系統(tǒng)(Alpha Innotech 公司)；Bio Rad 電泳儀及電泳槽(北京東方恒偉科技開發(fā)公司)；移液器(Gilson 產(chǎn)品)，Axygen無RNA酶槍頭及eppendorf管等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模方法 SD大鼠50只，給予普通飼料、自由飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，改高糖高脂飼料喂養(yǎng)，6周后，禁食12 h，斷尾取血并用美國強(qiáng)生血糖儀測(cè)空腹血糖。按30 mg/kg體重的劑量腹腔內(nèi)注射新鮮配制的2%鏈脲佐菌素(檸檬酸緩沖液，PH4.2)。72 h后尾靜脈取血測(cè)血糖，血糖高于16.7 mmol/L者確定為糖尿病模型制作成功。選取40只大鼠進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。

2.2 分組及給藥 將40只糖尿病大鼠隨即分為4組(n=10)：①模型對(duì)照組，②糖肝康小劑量組，③糖肝康大劑量組，④降糖甲對(duì)照組，每組10只。其中，模型對(duì)照組予生理鹽水10 mL/kg灌胃；糖肝康小劑量組予濃度為1.87 g/mL的糖肝康灌胃；糖肝康大劑量組予濃度為3.75 g/mL的糖肝康灌胃；降糖甲對(duì)照組予降糖甲混懸液56 g/kg灌胃。實(shí)驗(yàn)各組均給藥容積為10 mL/kg，每日灌胃1次，高脂飼料飲食，正常飲水。另取10只正常大鼠作為正常對(duì)照組，每日10 mL/kg生理鹽水灌胃，并予正常飼料飲食，正常飲水。室溫18～20 ℃，12 h交替照明。連續(xù)給藥12周。

2.3 組織標(biāo)本的采集 給藥觀察12周后，斷尾取血檢測(cè)各組動(dòng)物空腹血糖(取血前禁食8 h)。然后用戊巴比妥鈉30 mg·kg-1腹腔注射麻醉，開腹取出肝臟，用生理鹽水沖洗后，放入-80℃冰箱備用。

2.4 RT-PCR法檢測(cè)Obestatin

2.4.1 總RNA提取 按康為超純總RNA提取試劑盒(CW0581)說明書進(jìn)行。100 mg組織經(jīng)液氮研磨，加入1 mLTLbuffer，室溫放置5min，讓組織完全裂解。加200 uL氯仿，充分vortex15s，室溫放置2～3 min，12000 rpm離心15 min。將上清轉(zhuǎn)移到新的Eppendorf管內(nèi)。加等量的無水乙醇，混勻，將混合物加到離心柱上，12 000rpm離心30 s，加PW 1 700 uL，12 000 rpm離心30 s，加PW2 500 uL2次，12 000 rpm離心30 s，14 000 rpm離心2 min，加預(yù)熱的DEPC水50 uL，室溫放置2～3 min，12 000 rpm離心30 s收集RNA。RNA定量：SMA-1000測(cè)定RNA濃度，將濃度調(diào)整到一致。

2.4.2 RT-PCR反應(yīng)檢測(cè)Obestatin mRNA表達(dá)

PCR程序：94 ℃3 min，94 ℃ 30 s，60 ℃30 s，72 ℃1 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃5 min。

大鼠β-actin 上游引物：5’-GAG GGA AAT CGT GCG TGA C-3’，

大鼠β-actin下游引物：5’-GGA CTC ATC GTA CTC CTG CTT G-3，

擴(kuò)增產(chǎn)物：481bp

大鼠-Obestatin上游引物：5’-ATG GTG TCT TCA GCG ACT ATC T-3’

大鼠-Obestatin下游引物：5’ -CTC TGC TGG GCT TTC TGG-3’

擴(kuò)增產(chǎn)物：113 bp

2.4.3 電泳及數(shù)據(jù)分析 1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染料。Alpha Innotech imager觀察電泳條帶存入圖象，β-actin的產(chǎn)物為481bp，Obestatin的產(chǎn)物為113bp。以系統(tǒng)的SPOT DENSITY 軟件分別測(cè)量內(nèi)參照和Obestatin基因擴(kuò)增條帶的密度，以O(shè)bestatin條帶的密度與內(nèi)參照管家基因的密度比值代表基因表達(dá)的相對(duì)水平。

4 統(tǒng)計(jì)方法

5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

RT-PCR結(jié)果顯示：模型對(duì)照組大鼠肝臟組織中Obestatin mRNA表達(dá)水平較空白對(duì)照組明顯升高(P<0.05)；糖肝康大、小劑量組在給藥12周后，肝臟組織中Obestatin mRNA表達(dá)較模型對(duì)照組減少，有顯著性差異(P<0.05)，且效果優(yōu)于降糖甲對(duì)照組。見圖1及表1。

圖1 糖肝康對(duì)模型大鼠肝臟Obestatin mRNA表達(dá)的影響

注：M：空白對(duì)照組；A：空白對(duì)照組；B：模型對(duì)照組；C：降糖甲對(duì)照組；D：糖肝康小劑量組；E：糖肝康大劑量組

表1 糖肝康對(duì)模型大鼠肝臟Obestatin mRNA表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組相比，aP<0.05，bP<0.01；與模型對(duì)照組相比，cP<0.05，dP<0.01.

6 討論

近年來，隨著糖尿病發(fā)病率的急劇增高，糖尿病并發(fā)脂肪肝的發(fā)病率也有顯著增高的趨勢(shì)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道糖尿病肝損害的發(fā)生率為10%～30%。糖尿病脂肪肝的存在使糖尿病的治療難度加大，并直接影響糖尿病的療效和預(yù)后。如果能夠及早的發(fā)現(xiàn)糖尿病脂肪肝并做到有效的防治，對(duì)于提高糖尿病患者的生活質(zhì)量具有重大意義。因此，對(duì)糖尿病脂肪肝的研究，正在逐步引起醫(yī)學(xué)界的重視。

肥胖抑制素(Obestatin)是2005年[1]從大鼠胃組織中分離的一種Ghrelin相關(guān)肽，他可以結(jié)合孤兒G蛋白偶聯(lián)受體GPR39，產(chǎn)生與Ghrelin相反的作用。廣泛分布于大鼠的胃黏膜細(xì)胞、腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、睪丸問質(zhì)細(xì)胞[2]、十二指腸、空腸、結(jié)腸、胰腺[3]、以及人的唾液和唾液腺[4]中。Obestatin具有非常廣泛的生物學(xué)功能，可負(fù)向調(diào)節(jié)攝食和胃腸運(yùn)動(dòng)外[1]，也可作用于胰腺胰島組織抑制胰島素、胰多肽、生長抑素等的分泌[5]。齊曉婭比較了糖調(diào)節(jié)受損和2型糖尿病患者血漿Obestatin水平變化，結(jié)果顯示血漿Obestatin水平與體重指數(shù)、葡萄糖負(fù)荷后2 h血糖、糖化血紅蛋白、腰臀比、空腹胰島素和胰島素抵抗指數(shù)呈明顯負(fù)相關(guān)，低Obestatin水平與胰島素抵抗和2型糖尿病的發(fā)生密切相關(guān)[6]。另有研究表明obestatin與各種糖、脂代謝因素亦密切相關(guān)[7]。

本研究以肝臟組織中Obestatin的mRNA表達(dá)為切入點(diǎn)，分析糖尿病脂肪肝的發(fā)病機(jī)制及糖肝康對(duì)其的干預(yù)作用。結(jié)果證實(shí)：Obestatin mRNA在肝臟中表達(dá)較少。造模后大鼠的肝臟組織中Obestatin mRNA表達(dá)水平較正常大鼠升高。以健脾益氣、調(diào)肝解毒活血為組方原則研制的糖肝康對(duì)模型大鼠肝臟組織Obestatin mRNA表達(dá)有抑制作用。表明糖尿病脂肪肝患者的糖脂代謝紊亂、胰島素抵抗可能與Obestatin的異常表達(dá)相關(guān)，糖肝康可通過調(diào)節(jié)Obestatin mRNA表達(dá)，在糖、脂代謝、胰島素敏感度等方面起作用，值得進(jìn)一步深入研究。

[1]Zhang JV，Ren PG，Avsian-Kretchrner O，Luo CW，Rauch R，Klein C，Hsueh AJ.Obestatin，a peptide encoded by the ghrelin gene，opposes ghrelin`s effects on food intake.Science 2005；310：996～999.

[2]Ozbay Y，Aydin S，Dagli AF，Akbulut M，Dagli N，Kilic N，Rahman A，Sahin I，Polat V，Ozercan HI，Arslan N Sensoy D.Obestatin is present in saliva：alterations in obestatin and ghrelin levels of saliva and serum in ischemic heart disease.BMB Rep 2008；41：55～61.

[3]Aydin S，Ozkan Y，Erm an F，Gurates B，Kilic N，Colak R，Gundogan T，Catak Z，Bozkurt M，Akin O，Sen Y，Sahn I.Presence of obestatin in breast milk：relationship among obestatin，ghrelin.and leptin in lactating women.Nutrition 2008；24：689～693.

[4]Fujimiya M，Ataka K，Asakawa A，Inui A.Obestatin inhibits gastroduodenal motility in conscious fed rats via POMC pathway and CRF receptors in the brain.Autonomic Neuroscience 2007；135：41.

[5]Ataka K，Inui A，Asakawa A，Kato I，F(xiàn)ujimiya M.Obestatin inhibits motor activity in the antrum and duodenum in the fed state of conscious rats.Am[J]，Physiol Gastrointest Liver Physiol 2008；294：G1210～G1218.

[6]齊曉婭，楊剛毅，劉石紹，等.糖調(diào)節(jié)受損和2型糖尿病患者血漿obestatin水平降低[J].中華內(nèi)分泌代謝雜志，2007，23(6)：535～536.

[7]徐海蓉，鄭興，郭志福.單純性肥胖癥患者外周血ghrelin、obestatin的水平變化及其臨床意義[J].心臟雜志，2009，21(1)：95～98.