楊巧麗，顧政一，黃華，劉燕，王雪，姚華，史玉柱

（1石河子大學藥學院，石河子832000；2新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，烏魯木齊830004）

金蒿抗流感滴丸對小鼠TNF－α、IL－2和IFN－γ等細胞因子的影響

楊巧麗1，2，顧政一2，黃華2，劉燕2，王雪2，姚華2，史玉柱2

（1石河子大學藥學院，石河子832000；2新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，烏魯木齊830004）

為了觀察金蒿抗流感滴丸對小鼠細胞因子的影響，對其灌胃給藥7d后采血制備血清，采用ELISA法測定血清中腫瘤壞死因子α（TNF－α）的含量；以ConA誘導小鼠脾淋巴細胞增殖，ELISA法測定細胞上清液中白細胞介素2（IL－2）和γ干擾素（IFN－γ）的含量。結(jié)果顯示：金蒿抗流感滴丸0.05、0.1和0.2（g／kg）／d劑量組及利巴韋林組和復方一枝蒿顆粒組均能顯著促進小鼠血清中TNF－α的分泌（P＜0.05）；金蒿抗流感滴丸濃度為78.13～5000 μg／mL，對ConA誘導的小鼠淋巴細胞分泌IFN－γ和IL－2均有一定的促進作用。結(jié)論：金蒿抗流感滴丸對TNF－α、IL－2、，IFN－γ等細胞因子的分泌具有一定的調(diào)節(jié)作用，這可能是其發(fā)揮抗流感病毒作用的免疫機理之一。

金蒿抗流感滴丸；ELISA；TNF－α；IL－2；IFN－γ1

目前理想的抗流感病毒藥物卻很少，因而開發(fā)安全、有效、作用明確的抗流感病毒藥物就成為中外醫(yī)藥工作者亟待解決的問題。西藥中M2蛋白抑制劑金剛烷胺、金剛乙胺在臨床應用多年，但耐藥病毒株仍然逐年增加。流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑扎米那韋、奧斯他韋（達菲）是近年來被認為較有前景的新藥，但臨床應用也存在耐藥株的問題。干擾素和病毒唑?qū)住⒁倚土鞲胁《居行?，但均有一定副作用；流感疫苗雖較有效，但由于流感病毒抗原的變異性強，應用也受限［1］。而中藥因其毒副作用小，藥源豐富，價格低廉，其通過調(diào)節(jié)整體免疫功能抑制病毒復制，阻止病毒病變，改善臨床癥狀，因而近年來其逐漸成為醫(yī)學研究的熱點［2］。目前常用的抗流感病毒中藥研究方法大致分為直接抗流感病毒作用研究，包括體外實驗法、雞胚法和整體動物保護法［3－5］以及間接抗流感病毒研究，即抗病毒中藥通過調(diào)節(jié)機體的免疫功能而發(fā)揮的抗流感病毒作用。金蒿抗流感滴丸為新疆一枝蒿（Artemsia rupestris L.）和貫葉金絲桃（Hypericum perforatum）兩味藥材組成的復方制劑，臨床上主要用于治療流行性感冒。本課題組的前期研究顯示，其具有一定的抗流感病毒作用和免疫調(diào)節(jié)作用。

本實驗進一步觀察金蒿抗流感滴丸對與流感病毒感染密切相關(guān)的腫瘤壞死因子α（TNF－α）、白細胞介素2（IL－2）及γ干擾素（IFN－γ）水平的影響，從細胞因子水平探討金蒿抗流感滴丸抗流感病毒的免疫學機制，旨在為其臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗藥物

受試藥物：金蒿抗流感滴丸，棕色滴丸劑（批號090714），由新疆藥物研究所藥劑室提供，每丸35 mg（相當于藥材約0.7g），成人口服每次8丸，每日3次；陽性對照藥：復方一枝蒿顆粒，棕色顆粒劑（國藥準字Z20026711，10g／袋，批號：10020104），新疆西域藥業(yè)有限公司。利巴韋林片，白色片劑（規(guī)格：100mg，國藥準字 H20033538，批號1011022），江西匯仁藥業(yè)有限公司，用于病毒性呼吸道感染：成人1次0.15g，1日3次，連用7d。

1.1.2 實驗試劑

Hank's儲備液：KCl 20.0g，KH2PO40.3g，NaCl 40.0g，Na2HPO40.24g，葡萄糖5.0g，Mg－SO4·7H2O 1.0g，CaCl27.0g，酚紅0.5g，依次將上述試劑溶于雙蒸水并補足至1L，以NaOH（雙蒸水配制）調(diào)pH至6.7左右，過濾除菌，即為5倍濃縮的儲備液。應用時，取1份儲備液加4份重蒸水混合成pH 7.2的HBSS液。

RPMI－1640營養(yǎng)液：取 RPMI·1640培養(yǎng)基10.4g，HEPES 5.9g，谷氨酰胺300mg，丙酮酸鈉0.11g，NaHCO32.0g溶于重蒸水并補加至1000 mL，以NaHCO3調(diào)pH值至7.1左右，再加滅活的NBS（約相當于總體積的10%），以蔡氏濾器濾過除菌，無菌分裝，置0～4℃保存。

ConA（批號：C－2010），TBD 公司生產(chǎn)；RPMI1640（批號：1279327），GIBCO公司生產(chǎn)；胎牛血清（批號：100517），浙江杭州生物科技有限公司生產(chǎn)；ELISA試劑盒（R＆D公司）。

1.1.3 實驗動物

昆明種小鼠，60只，體重18～22g，雌雄各半，由新疆醫(yī)科大學實驗動物中心提供（動物合格證號：SCXK（新）2003－0001）；BALB／C小鼠，7只，體重20～22g，由新疆實驗動物研究中心提供，雌雄兼用（動物合格證號：SYXK（新）2003－0003）；所有動物雌雄分籠常規(guī)飼養(yǎng)。

1.1.4 實驗器材

BIO－RAD酶標儀（550），日本；蘇凈安泰超凈工作臺（SW－CT－2FD），蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；CO2培養(yǎng)箱（BPN－80CRH），上海一恒科學儀器有限公司；湘儀高速臺式冷凍離心機（TGL－16M），湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 對正常小鼠血清TNF－α含量的影響［6－7］

取小鼠60只，依體重、性別隨機分為對照組，利巴韋林組、復方一枝蒿顆粒組和金蒿抗流感滴丸小劑量組（0.05（g／kg）／d）、中劑量組（0.05 （g／kg）／d）和大劑量組（0.05（g／kg）／d）三個劑量的給藥組。對照組ig等體積蒸餾水，其余各組ig給藥，連續(xù)7 d，于末次給藥后2h采血制備血清。按ELISA試劑盒說明書中的操作測定血清中TNF－α的含量。

1.2.2 對ConA誘導小鼠淋巴細胞上清IL－2和IFN－γ含量的影響［6－9］

1.2.2.1 小鼠脾細胞懸液制備

脫頸椎處死BALB／C小鼠，用75%的酒精浸泡消毒30min，無菌條件下取出脾臟，放入盛有適量無菌Hank′s液的小平皿中稍清洗，轉(zhuǎn)移至下方盛有適量冷Hank′s液小培養(yǎng)皿的100目不銹鋼網(wǎng)篩中，用眼科剪將脾臟充分剪碎，Hank′s液沖洗過濾制成單個細胞懸液，細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，1000 r／min，離心10min，棄上清，離心管中加入適量0.83%NH4Cl，靜置低滲處理3min，除去紅細胞，1000r／min離心5min，棄上清液，完全培養(yǎng)液清洗沉淀3次（1000r／min，離心10min），以臺盼藍排除法計數(shù)活細胞數(shù)在95%以上。用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液，將細胞濃度調(diào)至2.0×106／mL。

1.2.2.2 IFN－γ和IL－2的誘生與測定

取上述脾淋巴細胞懸液（2.0×106／mL）接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔150.0μL；加入50.0μL ConA，使ConA終濃度為10.0μg／mL；再分別加入經(jīng)免疫學預實驗確定的不同濃度金蒿抗流感滴丸（濃 度 梯 度 分 別 為：5000、2500、1250、625、312.5、156.25、78.13μg／mL），復方一枝蒿顆粒（濃度梯度分別為：15000、7500、3750、875、937.5、468.75、234.38μg／mL）和利巴韋林片（濃度梯度分別為：200、100、50、25、12.5、6.25、3.13μg／mL）溶液各50.0μL，ConA對照組加入RBMI 1640液50μL，試驗組和對照組均設(shè)3個平行孔。然后將96孔培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，吸取上清，3000r／min，離心10min，獲上清液，分別采用雙抗體夾心ELISA法檢測各孔中IL－2和IFN－γ含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 對正常小鼠血清TNF－α含量的影響

各給藥組小鼠血清中TNF－α含量數(shù)值經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后，各組間進行單因素方差分析，統(tǒng)計結(jié)果見表1。表1表明：與正常對照組比較，金蒿抗流感滴丸0.05、0.1、0.2（mg／kg）／d劑量組及陽性對照利巴韋林組和復方一枝蒿顆粒組小鼠血清中TNF－α含量均有顯著提高（P＜0.05）。

表1 金蒿抗流感滴丸對小鼠血清中TNF－α水平的影響（，n＝10）Tab.1Effect of Jinhao anti－flu pills treatment on the TNF－αlevel in serum of mice

表1 金蒿抗流感滴丸對小鼠血清中TNF－α水平的影響（，n＝10）Tab.1Effect of Jinhao anti－flu pills treatment on the TNF－αlevel in serum of mice

注：F＝14.918，P＝0.000＜0.01；與正常對照組比較，＊表示P＜0.05，＊＊表示P＜0.01。

別 劑量／（（g／kg）／d） 動物數(shù)量 TNFα含量／（pg／mL）

2.2 對ConA誘導BALB／C小鼠淋巴細胞上清中IL－2和IFN－γ含量的影響

表2顯示，與ConA對照組比較，陽性對照組利巴韋林片在20.00～3.13μg／mL濃度和復方一枝蒿顆粒在15000.00～234.38μg／mL濃度對小鼠淋巴細胞上清液中IL－2和IFN－γ的生成均有一定促進作用，其中復方一枝蒿顆粒3750μg／mL濃度可以顯著促進小鼠淋巴細胞上清液中IFN－γ的生成（P＜0.05）；金蒿抗流感滴丸在5000.00～78.13 μg／mL濃度對ConA誘導小鼠淋巴細胞上清液中IL－2和IFN－γ的生成均有一定促進作用，其中78.13μg／mL濃度對ConA誘導小鼠淋巴細胞上清液中IL－2的生成有顯著促進作用（P＜0.05），2500、1250、625μg／mL濃度對小鼠淋巴細胞上清液中IFN－γ的生成有顯著的促進作用（P＜0.05）。

表2 金蒿抗流感滴丸對ConA誘導BALB／C小鼠淋巴細胞生成IFN－γ和IL－2水平的影響（，n＝10）Tab.1Effect of Jinhao anti－flu pills treatment on the level of IFN－γand IL－2in the serum of ConA－amplified spleen lymphocytes of BALB／C mice

表2 金蒿抗流感滴丸對ConA誘導BALB／C小鼠淋巴細胞生成IFN－γ和IL－2水平的影響（，n＝10）Tab.1Effect of Jinhao anti－flu pills treatment on the level of IFN－γand IL－2in the serum of ConA－amplified spleen lymphocytes of BALB／C mice

組別 樣品濃度／（μg／mL） IL－2含量／（pg／mL） IFN－γ含量／（pg／mL）654.06±176.64 1364.83±80.83利巴韋林片 200.00 651.83±135.00 1463.17±79.74 100.00 745.17±64.96 1551.5±172.99 50.00 708.50±44.85 1399.83±103.00 25.00 757.39±22.63 1551.5±100.37 12.50 759.06±27.76 1318.17±116.23 6.25 801.83±75.35 1363.17±316.08 ConA組 －3.13 762.39±120.39 1446.5±206.22

續(xù)表2

3 討論

TNF－α是一種重要的細胞因子。在病毒誘導的細胞因子釋放及在抗病毒感染中，TNF－α起著重要的作用［10－11］。

IL－2主要由CD4＋ T細胞產(chǎn)生，此外CD8＋細胞和NK細胞也可產(chǎn)生。在小鼠，主要由Th1亞群產(chǎn)生，IL－2本身無直接抗病毒作用，其能夠刺激T細胞產(chǎn)生多種淋巴因子，誘導CTL、NK、LAK等多種殺傷細胞的分化和效應功能，誘導殺傷細胞產(chǎn)生IFN－γ等細胞因子，而起到抗病毒作用。IFN－γ主要由T細胞和自然殺傷細胞所產(chǎn)生，它主要與免疫調(diào)節(jié)有關(guān)［12］，如誘導巨噬細胞、B細胞的抗原呈遞能力，活化NK細胞，提高其殺傷能力，活化的NK細胞又能分泌IFN－γ，從而使機體內(nèi)的NK細胞、IFN－γ和IL－2相互作用，形成免疫網(wǎng)絡(luò)，增強機體抗病毒和免疫調(diào)節(jié)作用。

本實驗觀察了金蒿抗流感滴丸對細胞因子的影響，結(jié)果顯示，金蒿抗流感滴丸能夠促進血清中TNF－α含量，同時對細胞中IL－2和IFN－γ的生成有一定促進作用。TNF－α、IL－2和IFN－γ等細胞因子在機體內(nèi)相互作用，在抗病毒和免疫調(diào)節(jié)作用中發(fā)揮著重要作用。本實驗研究從分子水平揭示了該藥對小鼠 TNF－α、IL－2 和IFN－γ等細胞因子的影響，為其進一步揭示該藥抗流感病毒作用的免疫機理奠定了一定的實驗基礎(chǔ)。

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Effect of Jinhao Anti－Flu Pills on Cytokines of TNF－α，IL－2 and IFN－γin Mice

YANG Qiaoli1，2，GU Zhengyi2，HUANG Hua2，LIU Yan2，WANG Xue2，YAO Hua2，SHI Yuzhu2
（1School of Pharmacy，Shihezi University，Shihezi 832000，China；2Xinjiang Institute of Meteria Medica，Urumqi 830004，China）

The objective of this study was to observe the effect of Jinhao anti－flu pills on the cytokines of mice.Tumor necrosis factorα（TNF－α）in the serum was measured by ELISA method after serum preparation using the blood sampled from the mice which were gavaged for seven days.Spleen lymphocytes were amplified under the ConA induction.Interleucocyte 2（IL－2）and γInterferon（IFN－γ）in the supernatant fluid were measured by the ELISA method.The results showed that dosage groups of 0.05，0.1and 0.2（g／kg）／d of Jinhao anti－flu pills，Ribavirin group，and compound Artemisiae rupestris granules group all significantly promoted the secretion of TNF－αin the mouse serum （P＜0.05）.Jinhao anti－flu pills in the concentration range of 78.13～5000μg／mL could promote ConA－induced secretion of IFN－γand IL－2from the lymphocytes of mice.Conclusion：Jinhao anti－flu pills have a certain regulating effect on the secretion of such cytokines as TNF－α，IFN－γ，IL－2，which may be one of the immunity mechanisms of its anti－influenza function.

Jinhao anti－flu pills；ELISA；TNF－α；IL－2；IFN－γ

R286；R285.5

A

1007－7383（2012）01－0056－04

2011－10－10

國家十二五重大藥物創(chuàng)制項目（2011ZX09102－009－07）

楊巧麗（1979－），女，碩士生，助理研究員，專業(yè)方向為藥物新制劑與新劑型；e－mail：qiaoliyang1006＠yahoo.com.cn。

顧政一（1957－），男，研究員，從事藥物新制劑與新劑型研究；e－mail：qiaoliyang1006＠yahoo.com.cn。