魏克娜，黃紅艷，張璐，鄒紅云，余伍忠，焦敏

（1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，石河子832002；2蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院眼科，烏魯木齊830000；3蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所，烏魯木齊830000）

葡萄膜炎患者外周血T細(xì)胞TCR BV亞家族克隆性的初步研究

魏克娜1，黃紅艷2，張璐1，鄒紅云3，余伍忠3，焦敏3

（1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，石河子832002；2蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院眼科，烏魯木齊830000；3蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所，烏魯木齊830000）

為探討葡萄膜炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）TCR BV CDR3譜系特點(diǎn)及多態(tài)性，為其免疫發(fā)病機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。采用RT－PCR擴(kuò)增TCR BV 26個(gè)亞家族CDR3的方法，經(jīng)免疫掃描譜型技術(shù)分析對葡萄膜炎患者PBMC中TCR BV CDR3的譜系漂移情況進(jìn)行研究。結(jié)果顯示：（1）5例正常健康人PBMC TCR BV CDR3譜型絕大多數(shù)呈正態(tài)（或高斯）分布，4例葡萄膜炎患者TCR BV CDR3掃描譜型均出現(xiàn)非正態(tài)分布的異常峰型，包括寡峰／寡峰趨勢，偏峰和不規(guī)則異常峰型；（2）在26個(gè)TCR BV亞家族中，不同亞家族異常峰型出現(xiàn)的頻率不同，非正態(tài)異常峰型出現(xiàn)頻率較高的亞家族有BV2和BV17（均為3／4），而BV5.2、BV6、BV15和BV18亞家族均未出現(xiàn)異常峰型；（3）TCR BV2和BV17兩個(gè)亞家族在HLA－B27陰性的3個(gè)患者均出現(xiàn)非正態(tài)異常峰型，而在HLA－B27陽性（合并強(qiáng)直性脊柱炎）的患者并未出現(xiàn)異常。葡萄膜炎患者PBMC TCR BV部分亞家族的異常表達(dá)可能與該病的免疫發(fā)病機(jī)理有關(guān)，為葡萄膜炎發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

葡萄膜炎；T細(xì)胞受體；BV亞家族；互補(bǔ)決定區(qū)3；免疫掃描譜型分析；克隆性

葡萄膜炎是較常見的一種眼部疾病，近年來，葡萄膜炎所致盲目在全部盲目病例中所占比例達(dá)4%～10%，且有持續(xù)上升的趨勢［1－2］，因此，葡萄膜炎的研究在致盲眼病領(lǐng)域中日益受到學(xué)者們的重視。其病因復(fù)雜，除了外傷、感染等因素可引起以外，多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為，自身免疫紊亂所致的葡萄膜炎為最常見和最重要的類型。因此，大量研究均從免疫學(xué)角度來探討其發(fā)病機(jī)制。自1973年Brewerton等［3］首次報(bào)道人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）B27與急性前葡萄膜炎（acute anterior uveitis，AUU）有密切相關(guān)性以來，免疫遺傳研究已發(fā)現(xiàn)20多種眼病與 HLA－B27抗原相關(guān)［4］。

對葡萄膜炎脈絡(luò)膜病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)炎癥區(qū)眼內(nèi)炎癥以淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞反應(yīng)為主，淋巴細(xì)胞彌漫浸潤整個(gè)脈絡(luò)膜，視網(wǎng)膜有不同程度的破壞［5］，表明體液免疫和細(xì)胞免疫均參與葡萄膜炎的發(fā)生過程。

近年來，葡萄膜炎被認(rèn)為是針對特定眼部蛋白的抗原特異性T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性反應(yīng)［6－7］。因而，T淋巴細(xì)胞在葡萄膜炎致病中的作用機(jī)制引起廣泛關(guān)注。目前，對葡萄膜炎相關(guān)免疫活性T細(xì)胞的研究報(bào)道非常少。

TCR是T細(xì)胞表面特異性識別抗原的分子，在TCR胚系基因的形成過程中，TCRβ鏈按等位排斥的方式先于TCRα鏈的重排，能較好反映T細(xì)胞TCR的特征。TCR重排過程中，互補(bǔ)決定區(qū)3（CDR3）形成高度可變區(qū)（NNDNJ區(qū)），是TCR直接與抗原決定簇結(jié)合的區(qū)域。不同重排其CDR3長度不同，通過檢測不同亞家族CDR3長度，可以了解TCR不同亞家族的克隆性特點(diǎn)。本研究擬采用基因掃描技術(shù)來分析探討葡萄膜炎患者TCR BV CDR3譜系特點(diǎn)及多態(tài)性，旨在為探索T細(xì)胞在葡萄膜炎免疫發(fā)病機(jī)制中的作用機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病例選擇

4例葡萄膜炎均來自蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院門診和住院患者，患者編號為U1～U4，其中U1～U3均為HLA－B27陰性，U4為HLA－B27陽性合并強(qiáng)直性脊柱炎（Ankylosing spondylitis，AS），其中女性1例（為U1），男性3例（為U2～U4），年齡為24～45歲。所有葡萄膜炎患者的診斷參照文獻(xiàn)［8］中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，強(qiáng)直性脊柱炎診斷符合文獻(xiàn)［9］中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并排除其他自身免疫性疾病和感染性疾病。5例正常健康人為對照。所有入選者采集乙二胺四乙酸二鉀（EDTA）抗凝靜脈血5mL。

1.2 RNA提取及cDNA合成

按RNA提取試劑盒（Omega Bio－Tek，美國）提取4例葡萄膜炎患者和2例正常健康人PBMC（2.0×106細(xì)胞）中的總RNA，RNA進(jìn)行濃度測定［10］，按照cDNA Kit條件合成cDNA。

1.3 TCR BV基因和TCR BC基因引物設(shè)計(jì)和合成

參照文獻(xiàn)［11－12］，合成 TCR BV 亞家族上游引物26條；TCR BC共用下游引物1條（內(nèi)側(cè)端帶FAM熒光標(biāo)記），TCR BC對照引物1條，引物由Invitrogen上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 PCR擴(kuò)增TCR BV基因26個(gè)亞家族

PCR反應(yīng)體積為50μL，含cDNA模板2μL，10 mmol／L dNTP 1μL，10×PCR Buffer（含 Mg2＋）5μL，TCR BV上游引物2μL（所有的TCR BV上、下游引物的應(yīng)用濃度均為10μmol／L），下游共用TCR BVFAM引物2μL，Taq DNA多聚酶1.25U。反應(yīng)條件為：94℃變性3min；94℃1min，55℃1min，72℃1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃10min延伸。PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠（溴乙錠染色）中進(jìn)行電泳，剩余PCR產(chǎn)物于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 基因掃描（GeneScan）分析T細(xì)胞克隆

取TCR BV各家族帶FAM熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物2μL，加入2μL去離子甲酰胺（Hi－Di Formamide，ABI），0.5μL 標(biāo)準(zhǔn)品（ABI，Genescan 500－Tamra，其中含有不同大小的熒光素Tamra標(biāo)記的DNA片段）及0.5μL上樣緩沖液（25mmol／L EDTA，50mg／mL blue dextran），94℃變性4min后，每管取2μL于6%變性聚丙酰胺凝膠中電泳2h，并用373ADNA序列分析儀（ABI，Perkin Elmer公司）分析結(jié)果，通過分析軟件GeneScan672、激光掃描及計(jì)算機(jī)收集電泳過程中不同時(shí)間所出現(xiàn)的不同顏色和強(qiáng)度的熒光素而顯示出不同位置、高度、顏色和形態(tài)的峰。

2 結(jié)果與分析

2.1 PBMC TCR BV 26個(gè)亞家族RT－PCR結(jié)果

正常健康人和葡萄膜炎患者的PBMC TCR BV26個(gè)亞家族及TCR BC對照均有表達(dá)，在2%瓊脂糖凝膠電泳圖上預(yù)測相應(yīng)大小處顯示1條特異性的條帶（圖1）。

2.2 TCR BV基因掃描分析結(jié)果

5例正常健康人PBMC TCR 26個(gè)BV亞家族多包含8～10個(gè)相差3bp片段大小的產(chǎn)物，因此譜型均呈現(xiàn)8～10個(gè)中間高，兩端低的鐘型峰圖，即呈正態(tài)分布或高斯分布（圖2）。

圖1 正常人TCR BV 26個(gè)亞家族和TCR BC對照產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 2%agarose gel electrophoresis of the PCR products of TCR BV families in a normal control

圖2 正常人PBMC TCR BV 26個(gè)亞家族CDR3譜型基因掃描分析圖Fig.2Spectratyping of CDR3sizes for all 26TCR BV gene families in PBMC in a normal control

所有患者外周血TCR BV CDR3亞家族掃描譜型中均出現(xiàn)非正態(tài)分布的異常峰型，包括寡峰、偏峰及不規(guī)則異常峰型，表明患者T細(xì)胞有寡克?。芽寺≡錾厔菁捌渌惓６嗫寺≡錾坏窗l(fā)現(xiàn)單克隆增生的亞家族。不同患者的TCR BV 26個(gè)亞家族異常峰型出現(xiàn)率為31%（8／26）～50%（13／26），其中U4患者異常峰型率最高（表1）；不同患者26個(gè)TCR BV亞家族中均出現(xiàn)3～9個(gè)寡克?。芽寺≮厔菰錾膩喖易?，其中U4（葡萄膜炎合并AS）患者寡克隆／寡克隆趨勢的峰型出現(xiàn)頻率最高（9／26）（表1）。

在26個(gè)TCR BV亞家族中，不同亞家族非正態(tài)異常峰型出現(xiàn)的頻率不同，非正態(tài)異常峰型出現(xiàn)頻率較高的亞家族有BV2和BV17（均為3／4），而BV5.2、BV6、BV15和BV18亞家族均未出現(xiàn)異常峰型；寡峰／寡峰趨勢出現(xiàn)頻率較高的亞家族為BV9、BV22、BV24（均為2／4）；偏峰出現(xiàn)頻率較高的亞家族為BV21（2／4）；不規(guī)則異常峰型出現(xiàn)頻率較高的亞家族為BV17（3／4）。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，TCR BV2和BV17在HLA－B27陰性的3個(gè)患者（U1～U3）中均出現(xiàn)異常峰型，而在HLA－B27陽性的患者（U4）并未出現(xiàn)這2個(gè)亞家族的異常（圖3）。

表1 4例葡萄膜炎患者TCR BV亞家族的異常峰型率Tab.1 4cases of uveitis patients TCR BV subfamily of the abnormal peak rate

圖3 葡萄膜炎患者TCR BV出現(xiàn)單、寡克隆增生、偏峰及不規(guī)則異常峰的家族Fig.3Monoclonal expansion，oligoclonal expansion，skewing family and abnormal family of TCR BV in the uveitis patients

3 討論

葡萄膜炎大多由自身免疫反應(yīng)所引起，視網(wǎng)膜中有多種抗原，每種抗原又有多個(gè)致葡萄膜炎活性多肽［13］。Yamamato等［14］用S抗原刺激葡萄膜炎患者體外培養(yǎng)的T淋巴細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)患者的T細(xì)胞發(fā)生免疫反應(yīng)，而無葡萄膜炎患者與正常對照組相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，因此，推測S抗原可能是一種自身隱蔽抗原，當(dāng)患者眼組織受損或者其他原因引起S抗原暴露后才誘發(fā)免疫反應(yīng)，從而造成葡萄膜炎性損傷。

對TCR BV 26個(gè)亞家族基因的克隆性特點(diǎn)進(jìn)行分析可以了解T細(xì)胞的性質(zhì)以及機(jī)體的免疫狀況。正常情況下，機(jī)體未受任何抗原刺激時(shí)，TCR BV重排是隨機(jī)的，T細(xì)胞表現(xiàn)為正態(tài)多克隆性；但在疾病情況下［15－18］，特殊的抗原刺激可引起某個(gè)或幾個(gè)亞家族的TCR BV針對性重排，出現(xiàn)異?？寺⌒栽錾瑑?yōu)勢表達(dá)的T細(xì)胞克隆可以抑制其它克隆的T細(xì)胞，造成機(jī)體免疫功能低下。

本研究采用免疫掃描譜型分析技術(shù)對5例正常健康人TCR BV亞家族的CDR3譜系分析發(fā)現(xiàn)26個(gè)亞家族RT－PCR產(chǎn)物大小不完全一致，提示T細(xì)胞在胚系發(fā)育重排時(shí)的多樣性。對4例葡萄膜炎患者TCR BV亞家族的CDR3譜系和克隆性表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，所有葡萄膜炎患者外周血T淋巴細(xì)胞均出現(xiàn)多個(gè)TCR BV亞家族譜型的異常改變，表明葡萄膜炎患者T細(xì)胞存在異常。葡萄膜炎患者部分亞家族出現(xiàn)寡克?。芽寺≮厔菰錾谋磉_(dá)情況，造成這種1個(gè)患者出現(xiàn)多個(gè)寡克隆增生的TCR BV亞家族以及不同患者不同家族呈現(xiàn)優(yōu)勢增生，這有可能是多種抗原所引起的一種特異性免疫應(yīng)答，說明在相關(guān)抗原的刺激下，TCR BV亞家族出現(xiàn)譜系多態(tài)性和異?？寺≡錾Ｄ壳皩@一過程以及克隆性增生的T細(xì)胞在體內(nèi)的功能意義還不十分清楚，仍需進(jìn)一步研究。每個(gè)患者出現(xiàn)多個(gè)寡克隆性T細(xì)胞增生表明葡萄膜炎抗原的多態(tài)性，不同患者出現(xiàn)的寡克隆T細(xì)胞的亞家族也不同，這可能與不同患者的反應(yīng)性不同有關(guān)。

本研究的結(jié)果還顯示，葡萄膜炎合并AS的U4患者出現(xiàn)寡克隆增生亞家族異常程度的頻率最高，提示葡萄膜炎合并AS的TCR BV亞家族異常程度有可能高于單純的葡萄膜炎，但由于本研究病例數(shù)較少，還有待于進(jìn)一步研究確證。

本研究對葡萄膜炎TCR BV CDR3譜型掃描分析結(jié)果僅發(fā)現(xiàn)了部分寡克隆／寡克隆趨勢增生的亞家族，未發(fā)現(xiàn)單克隆增生亞家族，進(jìn)一步增加樣本含量有可能發(fā)現(xiàn)更多的寡克隆甚至單克隆增生亞家族，有助于進(jìn)一步認(rèn)識葡萄膜炎患者TCR BV CDR3譜系多態(tài)性特點(diǎn)；進(jìn)一步對寡克隆增生亞家族CDR3進(jìn)行序列分析則有可能發(fā)現(xiàn)與葡萄膜炎相關(guān)的CDR3共同氨基酸序列，從而有可能為闡明葡萄膜炎特異性T細(xì)胞抗原在免疫發(fā)病機(jī)制中的確切作用，發(fā)現(xiàn)葡萄膜炎相關(guān)特異性抗原及免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制的探討提供有價(jià)值的線索，并為靶向免疫治療開辟新途徑。

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Study on the T cells of TCR BV CDR3 Lineage Polymorphism in Peripheral Blood of Uveitis Patients

WEI Kena1，HUANG Hongyan2，ZHANG Lu1，ZOU Hongyun3，YU Wuzhong3，JIAO Min3
（1Department of Immunology，School of Medicine，Shihezi University，Shihezi 832002，China；2Urumqi General Hospital of Lanzhou Command of PLA，Ophthalmology Dept，Urumqi 830000，China；3Urumqi General Hospital of Lanzhou Command of PLA，Institute of Clinical Medical Research，Urumqi 830000，China）

To study T cells lineage polymorphism of TCR BV CDR3in peripheral blood of uveitis patients so as to provide experimental basis to immune pathogenesis research in uveitis.T cells TCR BV 26subfamily CDR3of uveitis patients PBMC were amplified by RT－PCR method，then TCR BV CDR3lineages polymorphism were analyzed by immunization scanning spectrum.Results：1）Most spectral type of PBMC TCR BV CDR3in five normal controls showed Gauss distribution，TCR BV CDR3scanning spectrum of 4cases uveitis patients all showed abnormal distribution peak，including oligoclonal／oligoclonal trend，skewing peak and irregular abnormal peak；2）Frequencies of abnormal peak type occurrence varied in the 26TCR BV subfamilies：high frequency abnormal peak type subfamilies were BV2and BV17（both 3／4），while BV5.2，BV6，BV15and BV18subfamilies had no abnormal peak type；3）TCR BV2and BV17two subfamily in three patients with HLA－B27negative showed abnormal peak type，while HLA－B27positive（complicating ankylosing spondylitis）patients did not appear abnormal.Uveitis in patients with PBMC TCR BV subfamily expression might be related to immune pathogenesis.This study provides a foundation for further research into the mechanism of uveitis.

uveitis；T cell receptors；BV subfamilies；complementarity determining region3；immunoscope spectratyping；clonality

R392.9；R773.9

A

1007－7383（2012）01－0051－05

2011－12－16

國家自然科學(xué)基金（81172840），蘭州軍區(qū)醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金資助項(xiàng)目（CWS10JA21）

魏克娜（1982－），女，碩士生，專業(yè)方向?yàn)榉肿用庖?；e－mail：weiyi0922＠163.com。

鄒紅云（1970－），女，副主任醫(yī)師，從事自身免疫病發(fā)病機(jī)制的研究；e－mail：yijiamin2000＠163.com。