馬 赟，索菲婭，王傲立，盧 帥，葉 星，龔 健

(新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046)

不同居群的新疆蟲草發(fā)酵液體外抗氧化活性的研究

馬 赟，索菲婭，王傲立，盧 帥，葉 星，龔 健

(新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046)

目的 對不同居群的8種新疆蟲草發(fā)酵液進行體外抗氧化的研究。方法 采用還原能力測定法，F(xiàn)enton反應(yīng)法以及鄰苯三酚自氧化法研究新疆蟲草發(fā)酵液體外抗氧化活性。結(jié)果 DH001蟲草發(fā)酵液的還原力最強，吸光度值最大，達1．216;BH001蟲草發(fā)酵液和BE002蟲草發(fā)酵液清除羥自由基能力最大，清除率分別達98．7%和95．4%;8種蟲草發(fā)酵液清除超氧陰離子自由基活性均較低。結(jié)論 新疆蟲草發(fā)酵液具有一定的抗氧化活性。

新疆蟲草;發(fā)酵液;抗氧化

人體在有氧條件下的代謝過程都是氧化還原反應(yīng)，其中就會伴過氧化氫、自由基等物質(zhì)的生成，其中自由基是人體在生命活動中多種生化反應(yīng)的中間代謝產(chǎn)物。據(jù)報道，由氧自由基引起的疾病已超過100種，如:腫瘤、衰老、免疫性損傷、炎癥、某些藥物毒性等［1］。所以從天然植物資源中尋找高效、無毒且具有清除自由基活性的天然抗氧化物質(zhì)，對預(yù)防疾病、延緩衰老具有重要的意義。

新疆蟲草(Ophiocordyceps gracilis(Grev．)G．H．Sung，J．M．Sung，Hywel-Jones＆ Spatafora)為蟲草菌寄生在阿爾泰蝙蝠蛾(Hepialus altaicola W．)昆蟲幼蟲上的復(fù)合體［2］，為新疆傳統(tǒng)哈薩克民族藥，主要功效為補精髓、保肺腎、化痰等［3］。研究發(fā)現(xiàn)，新疆蟲草與冬蟲夏草有相同的化學(xué)成分，其中部分成分的含量接近甚至還略高于冬蟲夏草［4］。

目前，由于新疆蟲草的野生資源已面臨瀕危，人工培養(yǎng)蟲草已是大勢所趨。實驗證明天然蟲草與發(fā)酵制品的化學(xué)組成基本一致［5］，因此發(fā)酵產(chǎn)物常被用作替代品［6］。利用新疆蟲草液體發(fā)酵可以在較短的時間內(nèi)獲得大量菌絲體及其發(fā)酵產(chǎn)物，由于這一過程量高、周期短、且生產(chǎn)成本較低，因此，以藥食兩用的真菌作為天然抗氧化劑代替防腐劑應(yīng)用到食品防腐劑、食品添加劑、藥材等，不僅具有重大意義而且前景廣闊。

本研究以不同居群新疆蟲草為研究對象，通過搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，對其發(fā)酵液的抗氧化活性進行比較分析，為以新疆蟲草資源進行多種項目的開發(fā)和尋找冬蟲夏草生藥代替品提供科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料

新疆蟲草采自新疆阿勒泰山脈(白哈巴林場:BH001，BH002，BH003，BH004;布爾津林場:BE001，BE002;大河林場:DH001;本實驗室培養(yǎng)僵化的蟲草:SY001)。維生素C(Vc)及其他試劑均為分析純。

Spectrumlab 53型紫外可見分光光度計，上海精密科技有限公司。

2 方法

2．1 新疆蟲草發(fā)酵液的制備

取蟲草用水粗洗，再用75%乙醇擦洗表面2 min，然后在0．1%氯化汞溶液中消毒3 min，再用無菌水沖洗4～6次后，烘干。稱取蟲草0．100 0 g接入液體馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)搖菌管中［7］，120 r/min，25℃，120 h。所得發(fā)酵液過濾菌絲體，收集上清液。將得到的液體減壓濃縮，蒸干，稱取0．01 g溶于水10 mL中，備用。

2．2 體外抗氧化試驗

2．2．1 總還原能力測定［8］在試管中加入蟲草發(fā)酵液2．0 mL，加入 0．2 mol/L磷酸緩沖溶液(pH 6．6)0．4 mL 和 1%K3［Fe(CN)6］溶液 1．0 mL ，置50℃恒溫水浴中反應(yīng)20 min，再加入1%三氯乙酸溶液2．0 mL，取反應(yīng)液4 mL ，加水7．5 mL和1%FeCl3溶液0．3 mL，混勻，5 min后于700 nm 波長處測定吸光度(A)值，以水為空白對照。實驗重復(fù)3次，取平均值。以不同濃度Vc作陽性對照。

2．2．2 清除羥自由基(·OH)能力測定［9］利用Fenton反應(yīng)法對蟲草發(fā)酵液清除·OH能力的強弱來測定其抗氧化性的大小。取發(fā)酵液2 mL，依次加入6 mmol/L FeSO4溶液2 mL，2．4 mmol/L H2O2溶液2 mL，搖勻，靜置10 min，再加入6 mmol/L水楊酸溶液2 mL，搖勻，置37℃恒溫水浴30 min，于500 nm波長處測定樣品A值(A樣品);以Vc做陽性對照，同時設(shè)空白對照(A0)。清除率 =［1－(A樣品－AX0)/A0］×100%，其中AX0為不加水楊酸時發(fā)酵液自身的A值。

2．2．3 清除超氧陰離子自由基(O·－2)能力測定［10］

采用鄰苯三酚自氧化法。取0．05 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8．2)4．5 mL于試管中，置25℃水浴中預(yù)熱20 min，再依次加入蟲草發(fā)酵液 0．1 mL，2．5 mmol/L鄰苯三酚溶液0．4 mL，混勻后在25℃水浴中準確反應(yīng)5 min，立即加入8 mol/L HCl溶液2 mL終止反應(yīng)，在299 nm波長處測定A值(A樣品)，對照組用0．1 mL水代替蟲草發(fā)酵液，同時設(shè)空白管(A0)。清除率(%)=(A0－A樣品)/A0×100%。

3 結(jié)果

3．1 總還原能力測定

從圖1～2可看出，700 nm處A值越大表示還原能力越強。DH001蟲草發(fā)酵液的A值最大，達1．216，其余依次為 BH001，BH004，BE002，和 SY001發(fā)酵液，BE001蟲草發(fā)酵液還原力較低，A值僅為0．331。說明不同居群蟲草的發(fā)酵液都具有一定的抗氧化活性，其中以DH001和BH001還原力最強，強于 0．2 mg/mL Vc的還原力;BH004，BE002，和SY001發(fā)酵液還原力相差不大，相當于0．1 mg/mL Vc的還原力;BE001還原力相對較差。

圖1 Vc總還原力的測定Fig．1 Total reducing power of vitamin C

3．2 清除·OH能力

從圖3～4可看出，BH001和BE002發(fā)酵液清除·OH能力最大，清除率分別達98．7%和95．4%，相當于0．25 mg/mL Vc的清除率;其次為BE001和BH004，清除率分別為 82．4% 和 75．3%;SY001 發(fā)酵液的清除率最低，為27．89%。說明不同居群蟲草發(fā)酵液都具有一定的清除·OH能力，其中BH001和BE002蟲草發(fā)酵液最強。

圖2 不同居群蟲草發(fā)酵液總還原力的測定Fig．2 Total reducing power of the broth of different originated cordyceps

圖3 Vc清除·OH活性Fig．3 Scavenging capacity of vitamin C against·OH

圖4 不同居群蟲草發(fā)酵液清除·OH活性Fig．4 Scavenging capacity against·OH of the broth of different originated cordyceps

3．3 清除 O·－2能力

圖5 Vc清除 活性Fig．5 Scavenging capacity of vitamin C against

4 討論

實驗結(jié)果表明，大河林場采到的蟲草發(fā)酵液還原力較強，其次為白哈巴林場，布爾津林場，實驗室僵化最弱;白哈巴林場和布爾津林場的蟲草清除·OH能力較強，實驗室僵化最弱;白哈巴林場蟲草的 清除O·－

2能力較強，大河林場最弱。由此可見，不同居群的新疆蟲草因分布的環(huán)境氣候、海拔及采收期的不同，蟲草的品質(zhì)不同，發(fā)酵液的抗氧化能力強弱有差異;同一居群的蟲草也因采收期的不同，抗氧化活性有差異;同時也說明實驗室培養(yǎng)僵化的蟲草未達到自然生長條件，品質(zhì)相對較差。

圖6 不同居群蟲草發(fā)酵液清除活性Fig．6 Scavenging capacity of the broth of different originated cordyceps against

本文通過對新疆蟲草發(fā)酵液體外抗氧化的研究證實，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中含有成分復(fù)雜的活性物質(zhì)，對整體體外抗氧化作用的影響機制有待進一步研究。

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Study on antioxidation activity of the broth of different originated Ophiocordyceps gracilis(Grev．)G．H．Sung，J．M．Sung，Hywel-Jones ＆ Spatafora in vitro

MA Yun，SUO Fei-ya，WANG Ao-li，LU Shuai，YE Xing，GONG Jian
(School of Life Science and Technologe，Xinjiang University，Urumqi 830046，China)

Purpose To study the antioxdation capacities of the broth of Ophiocordyceps gracilis(Grev．)G．H．Sung，J．M．Sung，Hywel-Jones ＆ Spatafora which belong to 8 distinct groups．Methods The Ophiocordyceps gracilis(Grev．)G．H．Sung，J．M．Sung，Hywel-Jones＆ Spatafora broth have been tested for antioxidation activity by applying 3 methods，that are，reduction ability measuring，F(xiàn)enton reaction and pyrogallc acid self-oxydation．Results The broth of cordyceps DH002 showed the strongest reduction capacity and the highest light absorbtion index，which reached 1．216．The broth of cordyceps BH001 and BE002 demostrated the best hydroxy radical Scavenging capacity，of which the figures are 98．7%and 95．4%respectively．Each one of the 8 cordyceps brothes was with relatively lower activity to get rid of superoxide anion．Conclusion The broth of Ophiocordyceps gracilis(Grev．)G．H．Sung，J．M．Sung，Hywel-Jones ＆ Spatafora has anti-oxidant activity to some extent．

Ophiocordyceps gracilis(Grev．)G．H．Sung，J．M．Sung，Hywel-Jones＆ Spatafora;fermentation broth;anti-oxidation

Q946;R285．5

A

1005-1678(2012)06-0792-03

2012-03-26

新疆維吾爾科技支疆項目(201091245);新疆高等學(xué)?？蒲杏媱?XJEDU2010I12)

馬 赟，女，研究方向為生化制藥，E-mail:my20052009@126．com;索菲婭，通信作者，研究方向為植物資源，植物化學(xué)和新藥研發(fā)，E-mail:sophi3106@sina．com．cn。