劉 羽，王能飛＊，黃亦鈞，林學(xué)政，沈繼紅

（1.中國(guó)海洋大學(xué)，山東 青島266003；2.國(guó)家海洋局 第一海洋研究所，山東 青島266061；3.青島康地恩生物科技有限公司，山東 青島266061）

低溫脂肪酶基因在畢赤酵母中的表達(dá)研究＊

劉 羽1，2，王能飛1，2＊，黃亦鈞3，林學(xué)政2，沈繼紅2

（1.中國(guó)海洋大學(xué)，山東 青島266003；2.國(guó)家海洋局 第一海洋研究所，山東 青島266061；3.青島康地恩生物科技有限公司，山東 青島266061）

將已有的低溫脂肪酶基因克隆至表達(dá)載體pPICZα上，并轉(zhuǎn)化畢赤酵母X－33。在低溫條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)6d后，發(fā)酵液中可檢測(cè)到低溫脂肪酶活力。重組酵母發(fā)酵液加入二硫蘇糖醇后單位酶活力達(dá)到32U／mL，與未加入該試劑的原始菌株相比提高4倍以上。對(duì)重組脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)研究表明，其最適pH為8.0，最適溫度為35℃，50℃溫浴30min后，仍有30.04%的活性。以不同碳鏈長(zhǎng)度的4－Nitrophenyl Ester為底物檢測(cè)其底物特異性，結(jié)果顯示其較適合作用于短鏈底物。重組酵母能夠在BMMY培養(yǎng)基中胞外分泌表達(dá)帶有His標(biāo)簽的重組脂肪酶，經(jīng)鎳柱純化后，SDS－PAGE檢測(cè)可得到大約35kDa的單一蛋白質(zhì)條帶。

低溫脂肪酶；重組蛋白；畢赤酵母；組氨酸標(biāo)簽

脂肪酶（EC∶3.1.3.3）是一類水解油脂的酶類，可催化油水界面的甘油三酯水解生成甘油及長(zhǎng)鏈脂肪酸。脂肪酶可應(yīng)用于食品加工、油脂化學(xué)、精細(xì)化工、手性化合物拆分、高分子材料制備、生物柴油合成、去污劑添加劑等諸多工業(yè)領(lǐng)域［1］。工業(yè)中使用的脂肪酶多為中溫酶，其最適作用溫度為50℃。與中溫酶相比，低溫脂肪酶的優(yōu)點(diǎn)是活化能較低，在低溫條件下具有高酶活［2］。低溫脂肪酶在節(jié)能環(huán)保方面具有良好的應(yīng)用潛力，因而成為酶學(xué)研究新的熱點(diǎn)。

迄今，已有部分低溫脂肪酶基因被克隆并在大腸桿菌中表達(dá)［3］。然而，低溫脂肪酶在大腸桿菌中易形成沒(méi)有生物學(xué)活性的包涵體。如何實(shí)現(xiàn)該重組蛋白異源表達(dá)的高效性，依然是低溫微生物應(yīng)用研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是近年來(lái)發(fā)展迅速、應(yīng)用廣泛的一種真核表達(dá)系統(tǒng)［4］。畢赤酵母能將產(chǎn)生的外源蛋白分泌到培養(yǎng)基中，不會(huì)產(chǎn)生包涵體，有利于產(chǎn)物的純化。另外，作為一種低等真核生物，畢赤酵母除了具有生長(zhǎng)迅速、易于培養(yǎng)、遺傳操作簡(jiǎn)單等原核生物的特點(diǎn)外，還能對(duì)外源蛋白進(jìn)行糖基化、蛋白折疊和形成二硫鍵等翻譯后修飾，有利于異源基因的高效表達(dá)［5－7］?，F(xiàn)已有許多人如李娜，Holmquis等［8－9］成功將脂肪酶在該系統(tǒng)中高效表達(dá)。

本研究以南極菌株P(guān)sychrobactersp.G的低溫脂肪酶基因?yàn)槟０?，利用PCR技術(shù)將該低溫脂肪酶基因克隆至表達(dá)載體pPICZα中，成功構(gòu)建可用于畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的重組質(zhì)粒并在畢赤酵母X－33中表達(dá)，從而為批量培養(yǎng)和實(shí)際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

本研究所用菌株和質(zhì)粒見(jiàn)表1。將所有E.coli菌株置于LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)。抗生素終濃度為：每毫升含氨芐青霉素100μg，博來(lái)霉素40μg用于選擇大腸桿菌；博來(lái)霉素80μg用于重組的畢赤酵母工程菌。

表1 菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and Plasmids

1.1.2 試 劑

TaqDNA聚合酶，DNA連接酶，各種限制性內(nèi)切酶和DNA膠回收試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司；其它化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：ρ（酵母膏）＝5g／L；ρ（蛋白胨）＝10g／L；ρ（NaCl）＝10g／L；固體培養(yǎng)基加ρ（瓊脂粉）＝14 g／L；pH＝7.0；

YPD培養(yǎng)基：ρ（蛋白胨）＝20g／L；ρ（酵母粉提取物）＝10g／L；ρ（葡萄糖）＝20g／L；pH＝5.8（用3 mol／L HCl調(diào)節(jié)），固體培養(yǎng)基中ρ（瓊脂粉）＝14g／L；

YPDS培養(yǎng)基：向YPD培養(yǎng)基中加入山梨醇，ρ（山梨醇）＝180g／L；

BMGY和BMMY 培養(yǎng)基：ρ（蛋白胨）＝20g／L；ρ（酵母粉提取物）＝10g／L；ρ（YNB）＝13.4g／L；c（pH6.0磷酸緩沖液）＝100mmol／L；ρ（生物素）＝4×10－4g／L；φ（甘油）（BMGY）＝1%或φ（甲醇）（BMMY）＝0.5%；

“萬(wàn)金油buffer”：C（Tris）＝50mmol／L，pH＝7.9；C（EDTA）＝0.5mmol／L；C（NaCl）＝50mmol／L；ρ（甘油）＝50g／L。

1.2 方 法

1.2.1 PCR引物

根據(jù)脂肪酶基因序列（由林學(xué)政克隆提供，GenBank登錄號(hào)為GU247897）設(shè)計(jì)引物：

以上引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建

以948P1，948P2為引物，以質(zhì)粒pUC118－Lip－948為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：95℃4 min；95℃40s，58℃40s，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；72℃7min。PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行EcoRI／Xba I雙酶切；同樣，也對(duì)質(zhì)粒pPICZα進(jìn)行EcoRI和XbaI雙酶切。然后切膠回收，將目的基因和載體于16℃過(guò)夜連接；然后轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，在低鹽LB培養(yǎng)基（含40μg／mL博來(lái)霉素）上篩選轉(zhuǎn)化子并進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子，獲得表達(dá)載體pICZα－Lip。

1.2.3 在畢赤酵母中表達(dá)

利用SalI對(duì)載體pICZα－Lip進(jìn)行酶切，然后切膠回收。制備畢赤酵母電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞；加5μL線性載體到80μL畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)液中，電擊后的感受態(tài)細(xì)胞涂布于YPDS平板（含80μg／mL博來(lái)霉素）；挑選轉(zhuǎn)化子，利用特異引物（948P1和948P2）和畢赤酵母通用引物進(jìn)行菌落PCR篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。挑取陽(yáng)性克隆接種于BMGY液體培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，3 000r／min離心5min收獲菌體，再將其懸浮于BMMY培養(yǎng)基，20℃連續(xù)培養(yǎng)3～6d，每隔12h向BMMY培養(yǎng)基補(bǔ)加甲醇至終濃度0.5%，誘導(dǎo)重組低溫脂肪酶的表達(dá)。

1.2.4 表達(dá)產(chǎn)物的SDS－PAGE分析

將重組酵母的發(fā)酵液于4℃，3 000r／min離心10min，保留上清液。取10mL上清液，進(jìn)行親和層析，純化帶有His－tag的重組低溫脂肪酶：上清液與50%的Ni Sepharose 6Fast Flow填料混合，室溫低速震蕩1h。用結(jié)合緩沖液（每升含20mmol NaH2PO4，0.5mol NaCl，20mmol咪唑，pH7.4）洗去雜蛋白，用洗脫緩沖液（每升含20mmol NaH2PO4，0.5mol NaCl，500mmol咪唑，pH7.4）洗脫目的蛋白，進(jìn)行SDS－PAGE檢驗(yàn)蛋白純度和測(cè)定脂肪酶活性。

SDS－PAGE電泳方法參照 Laemmli［10］的研究。

1.2.5 重組脂肪酶的性質(zhì)

測(cè)定脂肪酶活性，選擇酶活力較高的重組酵母，誘導(dǎo)培養(yǎng)后取其發(fā)酵液，檢測(cè)其酶學(xué)性質(zhì)。

1.2.5.1 最適作用pH

以4－Nitrophenyl Esters（C4）為底物，測(cè)試重組脂肪酶在不同pH條件下的酶活力。pH值5～7為磷酸鈉緩沖液，pH值7～9為T(mén)ris－HCl緩沖液。

1.2.5.2 最適作用溫度

選擇最適作用pH，以4－Nitrophenyl Esters（C4）為底物，測(cè)定重組脂肪酶在不同溫度條件下的酶活。

1.2.5.3 溫度穩(wěn)定性

將酶液分別在不同溫度放置30min后取出，選擇最適pH，以4－Nitrophenyl Esters（C4）為底物，在最適溫度下測(cè)剩余酶活力。

1.2.5.4 最適作用底物

在最適作用pH，最適作用溫度下，分別以不同C鏈長(zhǎng)度的4－Nitrophenyl Esters作為底物，測(cè)定酶活。

1.2.6 重組低溫脂肪酶的活性分析

參照中華人民共和國(guó)輕工業(yè)部頒布標(biāo)準(zhǔn)GB／T1803—93（2002）中工業(yè)酶制劑通用的試驗(yàn)方法，將溫度設(shè)定為35℃。酶活單位定義：在反應(yīng)條件下，每分鐘水解三丁酸甘油酯釋放出1μmol脂肪酸所需要的酶量為一個(gè)脂肪酶國(guó)際單位（IU）。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪酶基因的PCR擴(kuò)增

通過(guò)PCR擴(kuò)增得到約1 000bp條帶（圖1）；克隆后測(cè)序分析表明該序列與先前獲得的低溫脂肪酶序列一致。對(duì)PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pPICZα分別進(jìn)行EcoRI和XbaI雙酶切；然后將回收的酶切產(chǎn)物連接過(guò)夜，獲得表達(dá)質(zhì)粒pPICZα－Lip。

2.2 脂肪酶基因在畢赤酵母X－33中的表達(dá)

pPICZα－Lip線性化后電轉(zhuǎn)導(dǎo)入畢赤酵母X－33中，涂布于博來(lái)霉素質(zhì)量濃度為80μg／mL的YPDS平板上，30℃放置3d后得到轉(zhuǎn)化子。挑選6個(gè)轉(zhuǎn)化子，利用特異引物（948P1和948P2）和畢赤酵母通用引物（5′AOX1primer和3′AOX1primer）進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子。結(jié)果表明特異引物擴(kuò)增出約900bp目的條帶（圖2a）；而通用引物（5′AOX1primer和3′AOX1primer）擴(kuò)增出約1 500bp條帶（圖2b）。由于通用引物擴(kuò)增含信號(hào)序列、目的基因和尾部His－tag標(biāo)簽，所以擴(kuò)增條帶大于目的脂肪酶基因。因此，所挑選的均為陽(yáng)性菌落。對(duì)特異引物（948P1和948P2）擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò)增無(wú)誤。

圖1 PCR擴(kuò)增的脂肪酶基因的瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of gene encoding cold－adapted lipase by PCR

圖2 菌落PCR驗(yàn)證Fig.2 Confirmation of recombinant P.pastoris Colonies PCR

2.3 轉(zhuǎn)化酵母的誘導(dǎo)表達(dá)

將1株帶有抗性基因的陽(yáng)性重組菌落命名為P.pastorisLip－1。對(duì)轉(zhuǎn)化子 Lip－1進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)利用0.5%甲醇誘導(dǎo)6d，于4℃3 000r／min離心10min，然后取上清。經(jīng)鎳柱純化，電泳顯示獲得目的重組蛋白，分子量在35kDa左右，與預(yù)測(cè)低溫脂肪酶分子量一致（圖3）。

2.4 重組低溫脂肪酶的酶活分析

以4－Nitrophenyl Esters為底物，測(cè)定誘導(dǎo)培養(yǎng)上清液的脂肪酶活性。結(jié)果顯示，對(duì)照菌株X－33中也存在一定的酶活，約為0.4IU；而重組菌株Lip－1上清酶活達(dá)15IU，說(shuō)明重組脂肪酶成功實(shí)現(xiàn)了表達(dá)。加入還原劑DTT，則使酶活增加了1倍（表2）。在某些情況下，EDTA和甘油可能會(huì)對(duì)酶活力有促進(jìn)作用，因此在測(cè)試酶活時(shí)也嘗試將標(biāo)準(zhǔn)方法的緩沖液換成含有EDTA和甘油的“萬(wàn)金油buffer”。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，確實(shí)能對(duì)酶活力有一定程度的促進(jìn)作用。

圖3 純化的重組脂肪酶SDS－PAGE分析Fig.3 SDS－PAGE analysis of purified recombinant lipase

表2 重組脂肪酶的活力檢測(cè)Table 2 The detection of activity of recombinant lipase

2.5 重組低溫脂肪酶的性質(zhì)

以4－Nitrophenyl Esters為底物，研究不同pH值對(duì)Lip－1表達(dá)的重組脂肪酶酶活影響。結(jié)果顯示，最適脂肪酶活性的pH值為8.0；pH值在7.0～8.5之間，脂肪酶活性都在最高活性的50%以上；當(dāng)pH值大于9.0時(shí)，脂肪酶活性開(kāi)始顯著下降（圖4）。最適溫度分析顯示，重組后脂肪酶的最適作用溫度為35℃，且在15℃仍有約60%的酶活力，表現(xiàn)低溫酶特性。在50℃孵育30min后仍有將近30%的酶活，溫度穩(wěn)定性較好（圖5）。以不同C鏈（C4～C16）長(zhǎng)度的4－Nitrophenyl Esters為底物檢驗(yàn)重組脂肪酶底物特異性。結(jié)果顯示，該重組低溫脂肪酶降解短C鏈的4－Nitrophenyl Esters底物時(shí)脂肪酶酶活最高，而底物C鏈越長(zhǎng)活性卻越低；8C鏈活性為42%，12C鏈活性約為30%，18C鏈活性僅不到20%（見(jiàn)圖6）。

3 討 論

巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有很多表達(dá)外源蛋白的優(yōu)勢(shì)，調(diào)控機(jī)理嚴(yán)格，分泌效率高，質(zhì)粒能在基因組的特定位點(diǎn)穩(wěn)定整合，重組轉(zhuǎn)化篩選簡(jiǎn)單，易于進(jìn)行高密度發(fā)酵，外源蛋白表達(dá)量高，還能對(duì)外源蛋白進(jìn)行翻譯后的修飾，并可將其分泌到培養(yǎng)基中，使分離純化較為簡(jiǎn)便［11］。本研究中X－33表達(dá)出的活性脂肪酶，上清酶活力為32U／mL，比原始菌株提高1倍，表明畢赤酵母對(duì)本實(shí)驗(yàn)原始菌株P(guān)sychrobactersp.G來(lái)說(shuō)，是一種有效的脂肪酶表達(dá)系統(tǒng)。

研究發(fā)現(xiàn)，加入一定量的DTT后可以使酶活有一定程度的提高，因?yàn)樗苁沟鞍踪|(zhì)保持還原狀態(tài)，更易使酶活中心暴露，起到穩(wěn)定作用。本研究采用的“萬(wàn)金油buffer”對(duì)酶活力的提高有一定作用，是由于其含有甘油和EDTA，所以對(duì)蛋白質(zhì)有保護(hù)穩(wěn)定的作用。

Catoni報(bào)道的重組脂肪酶最適作用溫度為25～37℃，高于37℃就急劇失活［12］，而本研究中重組脂肪酶的最適作用溫度為35℃，在50℃孵育30min后，仍能保持30%以上的酶活力，溫度穩(wěn)定性較好，最適作用pH值為8，比較適合作用于短鏈的底物。

本研究成功實(shí)現(xiàn)了低溫脂肪酶在畢赤酵母中的表達(dá)，具有在實(shí)際生產(chǎn)領(lǐng)域中應(yīng)用的潛力。下一步可以優(yōu)化重組畢赤酵母的發(fā)酵條件，以降低培養(yǎng)成本并嘗試在發(fā)酵罐中進(jìn)行高密度發(fā)酵，為實(shí)現(xiàn)大規(guī)模發(fā)酵做準(zhǔn)備。

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Expression of the Cold－adapted Lipase Gene inPichia pastoris

LIU Yu1，2，WANG Neng－fei1，2，HUANG Yi－jun3，LIN Xue－zheng2，SHEN Ji－h(huán)ong2
（1.Ocean University of China，Qingdao 266003，China；2.First Institute of Oceanography，SOA，Qingdao 266061，China；3.Continent Biotech Co.Ltd.，Qingdao 266061，China）

The cold－adapted lipase（CAL）gene was inserted into expression vector pPICZα，and transferred intoPichia pastorisX－33.After 6dcultivation under low temperature，lipase activity was detected in the fermentation broth.The lipase activity in the cultures of recombinedPichia pastorisreached to 32U／mL after inducement with DTT.The enzyme activity increased more than four times compared to those without adding DTT.The optimal temperature and pH for lipase activity were 35℃and pH8，and 30.04%of lipase activity still retained after incubating at 50℃for 30min.The recombinant CAL showed a preference to shorter carbon chain than the medium and long chain when tested with 4－nitrophenyl esters.The CAL with His tag was secreted extracellularly by the recombinedPichia pastorisin the BMMY medium and being purified by Ni2＋－NTA affinity chromatography.The purified protein showed a single band of about 35kDa on SDS－PAGE.

cold－adapted lipase；recombinant protien；Pichia pastoris；His－tag

Ocboter 7，2010

Q933

A

1671－6647（2012）01－0155－08

2010－10－07

國(guó)家高技術(shù)發(fā)展研究計(jì)劃項(xiàng)目——極地特殊海洋微生物資源利用的關(guān)鍵技術(shù)研究（2007AA091905）；海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)——鹽生植物生產(chǎn)纖維素乙醇與電廠廢氣聯(lián)產(chǎn)生物柴油研究與示范（201005031），利用極地微生物生產(chǎn)低溫纖維素酶關(guān)鍵工程化技術(shù)開(kāi)發(fā)與應(yīng)用研究（201005020－8），綠潮藻纖維素乙醇的制備技術(shù)研究（201105028－02）；國(guó)家海洋局海洋生物活性物質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金——南極冰藻L4Psbo基因在鹽度和光照脅迫的表達(dá)差異研究（MBSMAT－2009－02）；“十二五”國(guó)家科技計(jì)劃課題——微藻減排燃煤煙氣及二氧化碳和煉制生物柴油的關(guān)鍵技術(shù)和產(chǎn)業(yè)化示范（2011BAD14B04）

劉羽（1986－），女，山東棗莊人，碩士，主要從事極地微生物低溫酶方面研究.E－mail：xixiyu117＠163.com

＊通訊作者，E－mail：wangnengfei＠fio.org.cn

（王佳實(shí) 編輯）