蔣 偉，張 成，羅 元，黃啟芳，朱小東

(1.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院放療科，廣西桂林 541001；廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院：2.放療科；3.病理科，南寧 530021)

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種可促進(jìn)血管生成的內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原[1]。在腫瘤血管生成的各個(gè)環(huán)節(jié)中起重要作用，其表達(dá)與腫瘤患者生存期、轉(zhuǎn)移有關(guān)。存活蛋白是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族的一員[2]。在多種惡性腫瘤組織中呈高表達(dá)且與腫瘤細(xì)胞的分化增殖及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)VEGF和存活蛋白在鼻咽癌及正常鼻咽黏膜組織中的表達(dá)，探討二者與鼻咽癌臨床生物學(xué)行為的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 病例選自廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放療科1998年1月至2000年12月，隨訪5年以上的105例鼻咽癌患者。所有標(biāo)本均為放射治療前鼻咽腫物組織標(biāo)本，經(jīng)病理診斷為鼻咽低分化鱗癌，無放療禁忌證，有完整病歷資料。其中男83例，女22例；年齡15～72歲，中位43歲。臨床分期：Ⅰ期3例、Ⅱ期37例、Ⅲ期34例、Ⅳ期31例。其中T1、T2、T3、T4期分別為14、43、29、19例；N0、N1、N2、N3期分別為25、35、31、14例；M0、M1期分別為100、5例。另取10例正常鼻咽黏膜標(biāo)本做對(duì)照。105例鼻咽癌患者均行根治性放療。采用直線加速器8MV-X線或Co60-γ線常規(guī)分割照射，5次/周，每次2 Gy。鼻咽部照射劑量65～80 Gy/6～8周。

1.2試劑與方法 本組實(shí)驗(yàn)使用的一抗為鼠抗人VEGF、存活蛋白單克隆抗體，一抗、二抗、鏈霉卵白素-過氧化物酶(S-P)試劑盒和DAB試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。S-P免疫組織化學(xué)法：石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化等常規(guī)處理，并進(jìn)行抗原熱修復(fù)，按S-P法進(jìn)行流程染色，用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3結(jié)果判斷 由2位有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)生在不知道任何臨床和病理資料的情況下，對(duì)免疫組織化學(xué)切片結(jié)果進(jìn)行判斷。觀察染色切片并計(jì)數(shù)10個(gè)具有代表性的選染色均勻的高倍視野，在400倍鏡下觀察著色細(xì)胞占視野細(xì)胞總數(shù)，<5%為陰性(-)，5%～25%為陽性(+)，25%～50%為(++)，>50%為(+++)。聯(lián)合檢測(cè)鼻咽癌患者VEGF和存活蛋白表達(dá)情況，以VEGF和存活蛋白同時(shí)為-時(shí)，為陰性；VEGF和存活蛋白同時(shí)++以上為高表達(dá)；二者其余的表達(dá)方式組合為低表達(dá)。

1.4隨訪 全部患者放療結(jié)束時(shí)鼻咽部肉眼檢查均無腫瘤殘留。生存時(shí)間自患者開始治療之日算起，隨訪截止日期為2005年12月31日。隨訪方式包括返院復(fù)查、電話和信訪。隨訪5～7年,失訪5例,失訪者自失訪之日起按死亡計(jì)算，隨訪率為95% (100/105)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,各指標(biāo)間的相互關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)和Spearman秩相關(guān)分析，Kaplan-Meier 法描述各組的生存曲線，Log-rank 法行顯著性檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1鼻咽癌組織VEGF和存活蛋白表達(dá)情況 105例鼻咽癌標(biāo)本中，VEGF 染色可見細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)染色，以細(xì)胞質(zhì)染色為主； VEGF的表達(dá)情況：25例(-)、28例(+)、38例(++)、14例(+++)，陽性率為76%。存活蛋白染色可見細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核染色，以細(xì)胞核染色為主；存活蛋白的表達(dá)情況：44例(-)、25例(+)、18例(++)、18例(+++)，陽性率為58%。10例正常鼻咽黏膜組織VEGF和存活蛋白表達(dá)均為陰性，與鼻咽癌組織中陽性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表1、封2圖1。

表1 VEGF和存活蛋白在鼻咽癌與正常鼻咽黏膜組織中的表達(dá)

2.2聯(lián)合檢測(cè)VEGF和存活蛋白與鼻咽癌臨床病理特征相關(guān)性比較 經(jīng)Spearman相關(guān)分析，VEGF和存活蛋白的同時(shí)表達(dá)強(qiáng)度與鼻咽癌患者的年齡、T分期、TNM分期、顱底侵犯有明顯相關(guān)性(P<0.05)，見表2。

表2 聯(lián)合檢測(cè)VEGF和存活蛋白與鼻咽癌臨床病理特征相關(guān)性比較(n)

續(xù)表2 聯(lián)合檢測(cè)VEGF和存活蛋白與鼻咽癌臨床病理特征相關(guān)性比較(n)

2.3VEGF和存活蛋白在鼻咽癌組織中表達(dá)情況相關(guān)性比較 105例鼻咽癌患者組織中，VEGF和存活蛋白經(jīng)S-P法檢測(cè)同時(shí)表達(dá)-18例、+11例、++9例、+++7例，經(jīng)雙變量相關(guān)性分析，VEGF和存活蛋白呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 鼻咽癌組織中VEGF和存活蛋白表達(dá)情況相關(guān)性比較(n)

圖2 聯(lián)合檢測(cè)鼻咽癌患者VEGF和存活蛋白

2.4VEGF和存活蛋白表達(dá)情況與生存率的關(guān)系 聯(lián)合檢測(cè)鼻咽癌患者VEGF和存活蛋白表達(dá)情況，陰性、低表達(dá)、高表達(dá)患者的5年生存率分別為77.8%、67.7%、45.5%；Log-rank檢驗(yàn)陰性患者與高表達(dá)患者間生存率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

3 討 論

3.1鼻咽癌組織中VEGF和存活蛋白表達(dá)的相關(guān)性 腫瘤的發(fā)生發(fā)展是個(gè)多基因參與的過程，癌基因之間或者癌基因與抑癌基因之間相互調(diào)控，是癌變過程中的關(guān)鍵事件之一。O′Connor等[3]利用VEGF刺激存活蛋白低表達(dá)的靜止期血管內(nèi)皮細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明VEGF誘導(dǎo)存活蛋白表達(dá)為血管新生中維持內(nèi)皮細(xì)胞的生存能力提供了先決條件。Mesri等[4]利用存活蛋白的反義核苷酸抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞中存活蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)VEGF保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能減低。Tran等[5]研究發(fā)現(xiàn)，存活蛋白可有效地維持微小血管網(wǎng)的結(jié)構(gòu)，促進(jìn)的內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)功能，抵抗化療藥物對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的致凋亡作用。在國內(nèi)，秦建偉等[6]在研究乳腺癌存活蛋白定量表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)癌組織中存活蛋白表達(dá)水平與VEGF有明顯相關(guān)性。結(jié)合國外的基礎(chǔ)研究，作者選取了致癌機(jī)制完全不同的VEGF和存活蛋白作為研究對(duì)象，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鼻咽癌組織中VEGF表達(dá)與存活蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)，提示二者在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中有可能起著協(xié)同作用，彼此之間可能存在著相互調(diào)控機(jī)制，可進(jìn)一步展開研究。

3.2聯(lián)合檢測(cè)鼻咽癌組織中VEGF和存活蛋白的臨床意義 由于腫瘤組織中存活蛋白的高表達(dá)對(duì)增生的血管內(nèi)皮起著保護(hù)作用，作者聯(lián)合檢測(cè)了鼻咽組織中VEGF和存活蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)VEGF和存活蛋白的表達(dá)強(qiáng)度與鼻咽癌患者的年齡、T分期、TNM分期、顱底侵犯有明顯相關(guān)性,說明VEGF和存活蛋白的表達(dá)與腫瘤發(fā)展有一定關(guān)系。同時(shí)，比較了鼻咽癌組織中VEGF和存活蛋白同時(shí)陰性、低表達(dá)、高表達(dá)的生存率，結(jié)果顯示，二者陰性表達(dá)的患者5年生存率優(yōu)于二者高表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.036)。腫瘤的形成是一個(gè)多基因變異、多步驟、多階段的過程，不同的腫瘤基因之間彼此相互調(diào)控，形成一個(gè)巨大的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，所以在腫瘤標(biāo)志物與腫瘤相關(guān)性研究中，需要將不同的腫瘤分子指標(biāo)放在一起研究，選擇彼此最好的搭配。在作者的前期研究中，分別比較了VEGF和存活蛋白與鼻咽癌患者的生存率，發(fā)現(xiàn)二者不同表達(dá)對(duì)生存率沒有明顯的影響。本研究中發(fā)現(xiàn)VEGF和存活蛋白表達(dá)都是陰性的患者5年生存率明顯優(yōu)于均為高表達(dá)的患者，低表達(dá)患者5年生存率居于二者之間，準(zhǔn)確地反映了腫瘤的生物學(xué)規(guī)律?？梢赃@樣說，選擇的癌基因越多且癌基因在癌變通路中的作用越重要，得到的結(jié)果就越能準(zhǔn)確的反映腫瘤的預(yù)后。

有學(xué)者在甲狀腺癌、舌癌、大腸癌、肺癌、食管癌、宮頸癌等的研究中，得到了與本研究相似的結(jié)果[7-12]。Luo等[13]在喉鱗癌的研究的中發(fā)現(xiàn)VEGF和存活蛋白均為低表達(dá)患者的生存率較二者均高表達(dá)患者的生存率要高，為獨(dú)立影響預(yù)后因素，對(duì)預(yù)后的判斷有重要價(jià)值。周慷等[14]研究了存活蛋白和VEGF在多發(fā)性骨髓瘤中的表達(dá)及它們之間表達(dá)的相關(guān)性后，認(rèn)為二者可作為判斷多發(fā)性骨髓瘤預(yù)后的重要參考指標(biāo)，聯(lián)合檢測(cè)存活蛋白和VEGF的表達(dá)對(duì)了解多發(fā)性骨髓瘤腫瘤血管形成的機(jī)制有一定意義。劉敏等[15]探討存活蛋白和VEGF在涎腺腺樣囊性癌組織中的表達(dá)及二者的相關(guān)性，認(rèn)為存活蛋白和VEGF可能參與涎腺腺樣囊性癌的發(fā)生、發(fā)展。

總之，聯(lián)合檢測(cè)VEGF和存活蛋白的表達(dá)，能夠較好地判斷鼻咽癌的預(yù)后情況。

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