秦 強(qiáng) 謝正德 劉春艷 黃志卓 王亞麗 張 寒 趙曉曦 申昆玲

在感染相關(guān)的繼發(fā)性噬血細(xì)胞淋巴組織細(xì)胞增生癥(HLH)中，EB病毒相關(guān)HLH(EBV-HLH) 占HLH的50%以上，并且有著更差的預(yù)后[1～5]，且多見于兒童[6]。臨床研究證實(shí)HLH患者存在不同程度NK細(xì)胞活性減低，因而國(guó)際組織細(xì)胞病協(xié)會(huì)在HLH診斷標(biāo)準(zhǔn)中將NK 細(xì)胞活性減低作為依據(jù)之一[1]。有研究[7]顯示，78例EBV-HLH患者予免疫治療，隨訪43個(gè)月，57例(73.1%)存活，免疫治療的有效性提示了EBV-HLH具有一定的免疫異?；A(chǔ)，并對(duì)進(jìn)一步改善預(yù)后提供了可能。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(KIRs)基因多態(tài)性與EBV-HLH的發(fā)生相關(guān)。為進(jìn)一步明確EBV-HLH患兒NK細(xì)胞表面受體表達(dá)及功能是否存在異常，本研究采用配對(duì)病例對(duì)照研究方法，對(duì)EBV-HLH患兒和正常兒童進(jìn)行NK細(xì)胞表面受體表達(dá)和功能檢測(cè)，以期能深入了解EBV-HLH的發(fā)病機(jī)制。

1 方法

1.1 EBV-HLH診斷標(biāo)準(zhǔn) 符合國(guó)際組織細(xì)胞協(xié)會(huì)2004方案中HLH診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]，同時(shí)伴有EBV 感染的證據(jù)[8]：①血清學(xué)證實(shí)有EBV原發(fā)感染(抗EBV-VCA-IgM增高)或EBV感染的再激活(早期抗原EBV-EA-IgG或IgA增高)；②PCR或Southern blot方法檢測(cè)到EBV-DNA，血清、骨髓或淋巴結(jié)等受累組織中通過原位雜交法檢測(cè)到EBV編碼的RNA(EBER)。

1.2 EBV-HLH組納入和排除標(biāo)準(zhǔn) ①首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院(我院)住院患兒；②確診為EBV-HLH；③未接受過化學(xué)免疫治療；④排除攜帶家族性HLH(FLH)PRF1、UNC13D、STX11和SH2D1A基因缺陷者。

1.3 正常對(duì)照組納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 選取年齡、性別與EBV-HLH組1∶1匹配的我院兒童保健門診健康查體兒童，排除免疫系統(tǒng)疾病史者(如SLE，川崎病和原發(fā)性免疫缺陷病等)。

1.4 倫理和知情同意 本研究經(jīng)過我院倫理委員會(huì)審查通過。所有研究對(duì)象在納入研究前，均獲得患兒父母或監(jiān)護(hù)人同意，并簽署知情同意書。

1.5 NK細(xì)胞表面受體、穿孔素和CD107a表達(dá)檢測(cè) EBV-HLH組在應(yīng)用免疫化學(xué)治療前，采集肝素抗凝靜脈血4～6 mL，立即送檢。正常對(duì)照組留取肝素抗凝靜脈血4 mL，與EBV-HLH組標(biāo)本在相同實(shí)驗(yàn)室條件下檢測(cè)。

1.5.1 主要材料和試劑 單克隆熒光標(biāo)記抗體(NKG2D、DNAM-1、NKP30、NKP46、CD16、2B4和CD48)及相應(yīng)IgG或IgM同型對(duì)照(美國(guó)BD公司)；紅細(xì)胞裂解液(美國(guó)Beckman公司)；破膜劑和穿孔素單克隆抗體Intropep 1和 Intropep 2(美國(guó)Beckman公司)；穿孔素單克隆抗體及相應(yīng)同型對(duì)照(美國(guó)BD公司)；流式細(xì)胞儀(FACS flow cytometer，BD Biosciences,USA)。

1.5.2 NK細(xì)胞表面受體表達(dá)檢測(cè) 流式上樣管標(biāo)記后，分別加入肝素抗凝血100 μL。室溫孵育后加入不同抗體組合標(biāo)記，裂解紅細(xì)胞，洗脫后采用流式細(xì)胞儀定量分析NK細(xì)胞表面受體NKp30、NKp46、NKG2D和2B4表達(dá)(圖1)。

1.5.3 NK細(xì)胞穿孔素表達(dá)檢測(cè) 采用細(xì)胞膜抗體固定及破膜技術(shù)，用NK細(xì)胞特異性免疫熒光抗體標(biāo)記外周血NK細(xì)胞細(xì)胞膜表面受體和穿孔素，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)，定量分析NK細(xì)胞穿孔素的表達(dá)(圖2)。

1.5.4 NK細(xì)胞CD107a表達(dá)檢測(cè) 從肝素抗凝血中提取淋巴細(xì)胞，置CO2孵箱中過夜孵育，次日采用K562和P815作為靶細(xì)胞體外再激活NK細(xì)胞，采用熒光抗體P107a PE標(biāo)記，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)NK細(xì)胞表面CD107a表達(dá)(CD107a、CD107a/K562、CD107a/2B4/P815、CD107a/NKG2D/P815和CD107a/2B4/NKG2D/P815)，評(píng)價(jià)NK細(xì)胞活性(圖3)。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)NK細(xì)胞NKp46的表達(dá)

Fig 1 Surface activating receptor NKp46 expression on NK cells by flowcytometry

Notes The cells both expressed CD56 and NKp46 were considered in Quadrant 2(Q2) and the positive ratio was calculated

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)NK細(xì)胞穿孔素的表達(dá)

Fig 2 Perforin expression on NK cells by flowcytometry

Notes The cells both expressed CD56 and perforin were considered in Quadrant 2-2(Q2-2) and the positive ratio was calculated

1.5.5 IL-2介入實(shí)驗(yàn) 在制備的外周血淋巴細(xì)胞中加入IL-2(濃度1 000 IU·mL-1，用量10 μL·mL-1)，置于5%CO2孵箱中孵育48 h后再次測(cè)定CD107a表達(dá)情況，比較IL-2刺激前后CD107a表達(dá)變化。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 2009年8月至2011年5月8例患兒確診為EBV-HLH，均進(jìn)行了PRF1，UNC13D，STX11及SH2D1A基因篩查，未見突變。EBV-HLH組和正常對(duì)照組的一般情況見表1。

2.2 NK細(xì)胞表面受體和穿孔素表達(dá)情況 兩組在NK細(xì)胞表面受體NKp30、NKp46、NKG2D、DNAM-1和2B4表達(dá)陽(yáng)性率、CD56+NK細(xì)胞穿孔素表達(dá)率和CD8+T細(xì)胞穿孔素表達(dá)率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表1 EBV-HLH組和正常對(duì)照組的一般情況

Notes "+": positive; "-": negative; "±": probable positive

表2 NK細(xì)胞表面受體和穿孔素表達(dá)陽(yáng)性率在EBV-HLH組和正常對(duì)照組間的比較[%,M(P25,P75)]

Tab 2 Comparison of positive ratio of surface activating receptors and perforin expressed on NK cells between EBV-HLH group and control group[%,M(P25,P75)]

GroupsReceptorsNKp30NKp46NKG2DDNAM-12B4PerforinPerforin/CD56+Perforin/CD8+EBV-HLH(n=8)0.75(0.525,3.35)2.30(1.10,8.25)2.05(1.55,5.72)0.30(0.10,2.15)0.30(0.10,2.35)5.65(1.00,7.92)4.60(0.38,11.10)Controls(n=8)2.75(1.95,4.68)3.05(1.30,4.78)2.00(1.75,3.40)0.30(0.075,3.38)0.05(0.00,0.18)4.10(1.12,10.05)2.55(0.98,6.55)P0.2631.0000.6740.7330.2050.8890.484

2.3 IL-2刺激前后CD107a表達(dá) EBV-HLH組2例患兒因外周血淋巴細(xì)胞總數(shù)較低，提取的淋巴細(xì)胞數(shù)量不足以完成IL-2刺激前后CD107a表達(dá)測(cè)定，予以排除，最終6例EBV-HLH患兒納入分析。兩組在IL-2刺激前CD107a、CD107a/K562、CD107a/2B4/P815、CD107a/NKG2D/P815和CD107a/2B4/NKG2D/P815表達(dá)率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。兩組在IL-2刺激后，NK細(xì)胞CD107a表達(dá)差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

EBV-HLH組在IL-2刺激前后CD107a表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。正常對(duì)照組IL-2刺激前后CD107a、CD107a/K562和CD107a/NKG2D/P815表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

表3 IL-2刺激前后NK細(xì)胞CD107a表達(dá)在EBV-HLH組和正常對(duì)照組間的比較[%,M(P25,P75)]

Tab 3 Comparison of positive ratio of CD107a expression on NK cells before and after IL-2 stimulation between EBV-HLH group and control group[%,M(P25,P75)]

EBV-HLHgroup(n=6)BeforeAfterPControlgroup(n=6)BeforeAfterPP1)P2)CD107a0.70(0.00,3.75)2.90(0.25,9.10)0.6000.05(0.00,0.22)0.60(0.25,1.35)0.0430.1040.080CD107a/K56219.55(7.35,51.78)32.40(17.20,44.79)0.34516.85(6.22,32.95)52.15(29.60,64.42)0.0280.6000.173CD107a/2B4/P81510.60(1.30,31.50)16.72(3.25,18.98)0.9172.05(1.05,4.68)4.00(2.02,6.50)0.1160.0750.056CD107a/NKG2D/P81512.65(1.78,51.22)15.05(11.45,18.01)0.7536.15(1.32,15.58)17.50(5.60,26.00)0.0460.1160.463CD107a/2B4/NKG2D/P81515.00(4.58,52.32)17.80(9.92,21.08)0.6006.90(2.05,12.18)15.20(6.90,20.80)0.0750.1161.000

Notes 1) The comparison before IL-2 stimulation between EBV-HLH and control groups; 2) The comparison after IL-2 stimulation between EBV-HLH and control groups

3 討論

本研究結(jié)果顯示，EBV-HLH組和正常對(duì)照組間NK細(xì)胞表面受體和穿孔素表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示EBV-HLH患兒NK細(xì)胞功能的異常可能存在著與HLH不同的機(jī)制。IL-2刺激后正常對(duì)照組CD107a、CD107a/K562和CD107a/NKG2D/P815表達(dá)較刺激前顯著提高，EBV-HLH組較刺激前差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示EBV-HLH組NK細(xì)胞對(duì)IL-2的反應(yīng)出現(xiàn)異常，可能與EBV-HLH的發(fā)生有關(guān)。

51Cr釋放實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)NK細(xì)胞毒活性的金標(biāo)準(zhǔn)，但51Cr具有半衰期短和放射性等缺點(diǎn)。其他實(shí)驗(yàn)如乳酸脫氫酶(LDH)釋放法，受其敏感度低的缺點(diǎn)，也未能廣泛開展。溶酶體相關(guān)膜蛋白-1(LAMP-1或CD107a)是一種高糖基化的蛋白，約占溶酶體膜蛋白的50%[9]。NK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞時(shí)，毒性顆粒將到達(dá)漿膜面并與細(xì)胞膜融合，引起顆粒內(nèi)容物釋放，最終導(dǎo)致靶細(xì)胞的死亡[10]。隨著脫顆粒的發(fā)生，CD107a分子被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜表面，并且CD107a分子的表達(dá)上調(diào)與穿孔素的分泌一致[11]。因此，CD107a表達(dá)率的變化可以反映NK細(xì)胞殺傷活性的改變。

穿孔素受到多種細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，包括IL-2、lL-4、IL-6、IL-7、IL-12和IFN等都能夠增加穿孔素表達(dá)[12]。穿孔素和顆粒酶的表達(dá)降低受TGF-β、感染的遷延、病毒的致病力或腫瘤的影響，從而降低NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用[13]。有研究表明造血干細(xì)胞移植后血清顆粒酶、穿孔素水平的升高與CMV感染有明顯的相關(guān)性，其升高的水平不僅可預(yù)測(cè)CMV的發(fā)生，還可以評(píng)估抗CMV的治療[14,15]。但目前尚沒有EBV感染后相關(guān)研究的報(bào)道，本研究中，EBV-HLH組在CD56+NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞中穿孔素的表達(dá)和正常對(duì)照組間未發(fā)現(xiàn)顯著差異。因此，參照同屬于皰疹病毒科的CMV的研究結(jié)果[14,15]，推測(cè)如EBV-HLH患兒穿孔素表達(dá)異常，除進(jìn)行基因篩查排除遺傳因素外，應(yīng)注意其對(duì)常規(guī)治療的反應(yīng)，是否能成為臨床預(yù)后較差的指標(biāo)，還有待于進(jìn)一步大樣本的研究結(jié)果。

IL-2作用的靶細(xì)胞包括CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞和B細(xì)胞，可以引起效應(yīng)T細(xì)胞和B細(xì)胞的克隆性擴(kuò)增。同時(shí)IL-2可促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)其細(xì)胞毒殺傷作用。本研究EBV-HLH組在IL-2的刺激下，NK細(xì)胞CD107a、CD107a/NKG2D表達(dá)率未見顯著變化，與正常對(duì)照組不一致，從而不能正常的殺傷受EBV感染的細(xì)胞，導(dǎo)致感染的持續(xù)存在及機(jī)體免疫系統(tǒng)的持續(xù)激活。這同時(shí)也能解釋部分EBV感染患兒在沒有明顯免疫缺陷或基因缺陷的情況下，發(fā)生噬血現(xiàn)象的原因。

Marcenaro等[16]在對(duì)FLH的研究中發(fā)現(xiàn)，從FHL2型(PRF基因缺陷)和FHL3型(MUNC13-4基因缺陷)患者中分離的NK細(xì)胞，在經(jīng)過體外培養(yǎng)和IL-2刺激后，F(xiàn)HL3型組對(duì)K562靶細(xì)胞的殺傷作用明顯降低。進(jìn)一步研究提示，NKp30、NKG2D、2B4、CD16等表面受體表達(dá)也存在差異。但本研究發(fā)現(xiàn)，EBV-HLH組NKp30、NKp46等表面受體及穿孔素表達(dá)與正常對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示EBV-HLH的發(fā)病機(jī)制與FHL存在不同，需要進(jìn)一步研究。

本研究的不足之處和局限性：①由于EBV-HLH發(fā)病機(jī)制不清，臨床診斷困難，且入選病例需要未經(jīng)過化療的患兒，病例來源較少。②由于實(shí)驗(yàn)步驟較多，受外界因素影響較大，盡管每檢測(cè)1例患兒，同時(shí)都會(huì)選取1例相匹配的正常對(duì)照，盡量做到條件一致，但外周血單核細(xì)胞計(jì)數(shù)差別較大，而實(shí)驗(yàn)所添加的抗體的量是一致的，使數(shù)據(jù)離散度較大。③本研究未設(shè)立單純EBV感染組，對(duì)于NK細(xì)胞活性的改變是由EBV所致、HLH所致抑或是EBV和HLH的共同作用無法更確切地說明。

[1]Henter JI,Horne AC,Aricó M,et al. HLH-2004: Diagnostic and therapeutic guidelines for hemophagocytic lymphohistio-cytosis. Pediatr Blood Cancer,2007,48(2):124-131

[2]Stadt U,Beutel K,Kolberq S,et al. Mutation spectrum in children with primary hemophagocytic lymphohistiocytosis: molecular and functional analyses of PRF1,UNC13D,STX11,and RAB27A. Hum Mutat,2006,27(1):62-68

[3]Rouphael NG,Talati NJ,Vaughan C,et al. Infections associated with haemophagocytic syndrome. Lancet Infect Dis,2007,7(12):814-822

[4]Ishii E,Ohga S,Imashuku S,et al. Nationwide survey of hemophagocytic lymphohistiocytosis in Japan. Int J Hematol,2007,86(1):58-65

[5]Jin YK,Xie ZD,Yang S,et al. Epstein-Barr virus-associated hemophagocytic lymphohistiocytosis: a retrospective study of 78 pediatric cases in mainland of China. Chin Med J,2010,123(11):1426-1430

[6]Su IJ. Perspectives on the pathogenesis and therapy of hemophagocytic syndrome. J Formos Med Assoc,2008,107(4):277-280

[7]Imashuku S,Teramura T,Tauchi H,et al. Longitudinal follow-up of patients with Epstein-Barr virus-associated hemophagocytic lymphohistiocytosis. Haematologica,2004,89(2): 183-188

[8]Imashuku S. Clinical features and treatment strategies of Epstein-Barr virus-associated hemophagocytic lymphohistio-cytosis. Crit Rev Oncol Hematol,2002,44(3):259-272

[9]Kannan K,Stewart RM,Bounds W,et al. Lysosome-associated membrane proteins h-LAMPl(CD107a) and h-LAMP2(CD107b) are activation-dependent cell surface glycoproteins in human peripheral blood mononuclear cells which mediate cell adhesion to vascular endothelium. Cell Immunol,1996,171(1)：10-22

[10]Lettau M,Schmidt H,Kabelitz D,et al. Secretory lysosomes and their cargo in T and NK cells. Immunol Lett,2007,108(1):10-19

[11]Alter G,Malenfant JM,Altfeld M,et al. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. Immunol Methods,2004,294(1):15-22

[12]Yu CR,John R. Role of a STAT Binding Site in the Regulation of the Human Perforin Promoter. J Immunol,1999,62(5)：2785-2790

[13]Chochi K,Ichikura T,Majima T,et al. The increase of CD57+T cells in the peripheral blood and their impaired immune functions in patients with advanced gastric cancer. Oncol Rep,2003,10(5)：1443-1448

[14]Jakson M,Remberger M,Mattsson J. Increased immune transcript levels are correlated with acute graft-versus host disease and cytomegalovirus response after allogeneic stem cell transplantation. Transplantation,2004,77(2)：195-200

[15]Kircber B,Sehumaeher P,Nachbaur D. Granzymes A and B serum levels in allo-HSCT. Bone Marrow Transplant,2009,43(10)：787-791

[16]Marcenaro S,Gallo F,Martini S,et al. Analysis of natural killer-cell function in familial hemophagocyticlymphohistiocytosis(FHL): defective CD107a surface expression heralds Munc13-4 defect and discriminates between genetic subtypes of the disease. Blood,2006,108(7):2316-2323