鄭金華

(貴陽醫(yī)學(xué)院 附屬醫(yī)院 眼科，貴州 貴陽 550004)

木蝴蝶提取物對大鼠實(shí)驗(yàn)性脈絡(luò)膜新生血管的抑制作用

鄭金華

(貴陽醫(yī)學(xué)院 附屬醫(yī)院 眼科，貴州 貴陽 550004)

目的 探討木蝴蝶提取物對實(shí)驗(yàn)性脈絡(luò)膜新生血管的抑制作用，并分析其可能機(jī)制。方法 脈絡(luò)膜新生血管模型大鼠90只隨機(jī)分為激光光凝對照組(A組)、木蝴蝶提取物組(B組)和生理鹽水組(C組)，A組不給藥，B組給予木蝴蝶提取物100 mg/kg，C組給予生理鹽水。分別在第1，7，21和28天觀察新生血管發(fā)生率和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)陽性表達(dá)情況。結(jié)果 脈絡(luò)膜新生血管發(fā)生率都在第21天達(dá)高峰，B組與A、C兩組比較有顯著差異(P＜0．05)。從第7天開始，A、C兩組光鏡下均可見光凝斑部位機(jī)化增厚，Bruch膜破裂，B組在早期的炎癥反應(yīng)較輕。第3和7天，各組視網(wǎng)膜各層VEGF陽性表達(dá)無顯著差異(P＞0．05)。第14和21天，A、C組VEGF陽性表達(dá)明顯高于B組(P＜0．05或0．01)。結(jié)論 木蝴蝶提取物可以防治脈絡(luò)膜新生血管的早期形成，VEGF在新生血管形成的早期起著關(guān)鍵性的作用。

木蝴蝶提取物;脈絡(luò)膜新生血管;抑制作用;光凝

脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)是多種病因引起的來源于脈絡(luò)膜的新生血管形成，因其多發(fā)生于黃斑區(qū)，常引起患者中心視力下降，甚至導(dǎo)致失明［1-2］。在美國，超過65歲的人口中，將近20%患有老年性黃斑變性，而我國50歲以上的人口中患病率也在6% ～15%，其90%失明是由脈絡(luò)膜新生血管引起的［3-4］。目前西醫(yī)缺乏特異性好、療效顯著、不良反應(yīng)少的脈絡(luò)膜新生血管防治方法，積極利用中藥提取物種類繁多、作用廣泛的特點(diǎn)，開發(fā)中藥防治脈絡(luò)膜新生血管是一個方向。

木蝴蝶為紫葳科植物木蝴蝶的成熟種子，是一種常用中藥。木蝴蝶化學(xué)成分以黃酮及其苷類為主，許多成分在黃芩中都已經(jīng)發(fā)現(xiàn)過，可煎服、研末服用或外用敷貼。現(xiàn)代藥理研究表明，木蝴蝶可以糾正模型大鼠晶狀體的代謝紊亂，對大鼠半乳糖白內(nèi)障有預(yù)防和治療作用［5-6］。本文探討了木蝴蝶提取物對實(shí)驗(yàn)性脈絡(luò)膜新生血管的抑制作用，并探討其可能作用機(jī)制，以期尋找一種新的藥物治療脈絡(luò)膜新生血管的思路。

1 材料

木蝴蝶提取物(每1 g相當(dāng)于生藥10 g)，西安賽奧生物技術(shù)有限公司。碘化丙啶(PI)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、RPMI 1640培養(yǎng)基、小牛血清、EDTA Hanks液，上海生物工程有限公司;血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)原位雜交試劑盒，博士德試劑公司;SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒，廣東中山試劑公司。

視網(wǎng)膜電圖，美國Nicolet公司;半導(dǎo)體激光機(jī)，德國CanlzeiS公司。

Brown Norway(BN)大鼠，雌性，體重為200～300 g，購自北京動物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號:SCXK(京)2007-0001。

2 方法

2．1 脈絡(luò)膜新生血管模型的建立

BN雌性大鼠，經(jīng)過裂隙燈顯微鏡檢查及眼底檢查，排除屈光介質(zhì)和眼底異常大鼠。采用激光光凝誘導(dǎo)形成脈絡(luò)膜新生血管。

大鼠腹腔注射氯胺酮(5 mg/kg)麻醉，雙眼滴0．5%托吡卡胺溶液，將大鼠置于半導(dǎo)體激光機(jī)前，調(diào)整激光波長為810 nm，曝光時間0．1 s，光斑100 μm，通過裂隙燈眼底鏡將瞄準(zhǔn)光斑聚焦在視網(wǎng)膜上，然后進(jìn)行光凝，每只眼光凝10次，光凝過程中適當(dāng)調(diào)整激光功率(100～140 mW)，使激光光斑反應(yīng)為Ⅲ級，以擊穿Bruch膜。術(shù)后裂隙燈下檢查雙眼均未出現(xiàn)明顯的眼底出血或玻璃體出血。

2．2 分組及給藥

取模型大鼠90只，隨機(jī)分為3組:激光光凝對照組(A組)、木蝴蝶提取物組(B組)、生理鹽水組(C組)，每組30只。

A組大鼠不給藥，B組大鼠灌胃給予木蝴蝶提取物100 mg/kg，C組大鼠灌胃給予等體積生理鹽水，1 次/d。

2．3 觀察指標(biāo)

2．3．1 熒光素眼底血管(FFA)于激光光凝后第1，7，14，21和28天3組大鼠各取6只，用腹腔注射3%戊巴比妥鈉(1 mg/kg)麻醉后，以10%熒光素鈉(0．5 mg/kg)腹腔注射后立即開始攝影，觀察脈絡(luò)膜新生血管光斑數(shù)，計算脈絡(luò)膜新生血管發(fā)生率。脈絡(luò)膜新生血管發(fā)生率=(脈絡(luò)膜新生血管光斑數(shù)/鼠眼總光斑數(shù))×100%。

2．3．2 組織學(xué)檢查 大鼠在相應(yīng)時間點(diǎn)結(jié)束FFA檢查后，用4%多聚甲醛全身灌流固定。隨著每組各兩只大鼠全身肌肉及尾部出現(xiàn)肌肉顫動為灌流成功，立即取出大鼠眼球。眼球置入4%甲醛固定液中室溫過夜后，取視網(wǎng)膜，切成0．1 mm×0．5 mm×0．4 mm的組織塊，磷酸緩沖液漂洗，鋨酸固定，脫水包埋，切片，作HE染色及VEGF免疫組化染色。進(jìn)行透射電鏡觀察。按試劑盒說明進(jìn)行操作，用醫(yī)學(xué)專業(yè)圖像分析系統(tǒng)測定，計算VEGF的相對表達(dá)量。

3 結(jié)果

3．1 脈絡(luò)膜新生血管的發(fā)生率

3組脈絡(luò)膜新生血管發(fā)生率都在第21天達(dá)高峰，B組與A、C兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)。A與 C組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0．05)。見表1。

表1 3組不同時間點(diǎn)脈絡(luò)膜新生血管的發(fā)生率比較

3．2 HE染色與電鏡觀察

從第7天開始，A組可見明顯脈絡(luò)膜新生血管形成，光凝斑部位機(jī)化增厚，Bruch膜破裂;B組未見視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的明顯異常，光凝早期的炎癥反應(yīng)較輕;C組可見細(xì)胞移行，成纖堆細(xì)胞增生，光凝斑部位機(jī)化增厚，Bruch膜破裂。見圖1。

3．3 VEGF免疫組化染色

第1和7天，各組視網(wǎng)膜VEGF陽性表達(dá)比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0．05)。第14天，A、C組VEGF陽性表達(dá)明顯高于B組(P ＜0．05)。第21天，A、C組VEGF陽性表達(dá)進(jìn)一步提高，明顯高于B組(P＜0．01)。第28天，各組VEGF陽性表達(dá)均有所減弱。見表2。

圖1 脈絡(luò)膜新生血管形成觀察結(jié)果(HE染色，200×)

表2 3組不同時間點(diǎn)VEGF在視網(wǎng)膜上表達(dá)比較(n=6，x±s)

4 討論

木蝴蝶為紫葳科木蝴蝶屬植物木蝴蝶的成熟種子，主要功效是清熱利咽，舒肝和胃。有學(xué)者首先建立誘發(fā)糖性白內(nèi)障模型，然后預(yù)防組在每日給予半乳糖的同時灌喂木蝴蝶水煎劑4 g/kg，結(jié)果半乳糖模型組第10天開始出現(xiàn)核混濁;而木蝴蝶組第20天才開始出現(xiàn)核混濁，保持大鼠透明晶狀體的百分率明顯高于半乳糖模型組，表明木蝴蝶可以糾正模型大鼠晶狀體的代謝紊亂，對大鼠半乳糖白內(nèi)障有預(yù)防和治療作用［7］。

在實(shí)驗(yàn)性脈絡(luò)膜新生血管中，目前多采用激光誘導(dǎo)的鼠的脈絡(luò)膜新生血管動物模型，該模型已廣泛用于新生血管抑制劑的篩選和相關(guān)脈絡(luò)膜新生血管基因水平的研究［8］。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計利用半導(dǎo)體激光光凝損傷脈絡(luò)膜、Bruch膜產(chǎn)生一個炎癥、新生血管和損傷修復(fù)的過程，而建立脈絡(luò)膜新生血管動物模型。本文結(jié)果顯示，木蝴蝶提取物可減少脈絡(luò)膜新生血管的形成。

新生血管形成是許多血管生長因子介導(dǎo)的，如VEGF。VEGF一方面促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂增生、遷徙、誘導(dǎo)血管腔的形成;一方面促進(jìn)血管通透性增加，使血液中的纖維蛋白原等進(jìn)入細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)形成纖維蛋白等，胞外纖維蛋白作為暫時性的基質(zhì)允許新生血管和基質(zhì)細(xì)胞的內(nèi)向性生長，在某種程度上VEGF引起的血管通透性增加是被理解為血管形成的先決條件。本文結(jié)果顯示，木蝴蝶提取物可減少視網(wǎng)膜VEGF的陽性表達(dá)。

在木蝴蝶的化學(xué)成分組成中，有黃芩苷元、黃芩苷、野黃芩素、黃芩苷元-6-葡萄糖醛酸、野黃芩苷等組分，而黃芩苷主要作用是抗氧化、清除自由基、抗炎、抗病，在眼科方面主要應(yīng)用其抗病毒和調(diào)節(jié)免疫的功效，用來治療病毒性角膜炎，我們認(rèn)為發(fā)揮作用的可能是木蝴蝶提取物中的黃芩苷類化合物。

總之，木蝴蝶提取物可以防治脈絡(luò)膜新生血管的早期形成，VEGF在新生血管形成的早期起著關(guān)鍵性的作用。

［1］ Jeffreyl，Edelman，Marisol R．Quantitative image analysis of laserinduced choroidal neovascularization in rat［J］．Exp Eye Res，2010，71(2):523-533．

［2］ Yasuo T，Toru Ka，Tsuyosbi K，et al．Suppression of laser induced choroidal neovascularization by oral tranilast in the rat［J］．Invest Ophthamol Vis Sci，2009，40(2):459-466．

［3］ 趙勁松，宋 躍．胚胎視網(wǎng)膜血管發(fā)生方式及其促進(jìn)因子［J］．眼科研究，2010，18(1):89-91．

［4］ 秦力雄，余婉容，張文其，等．漢防甲素對體外培養(yǎng)的免結(jié)膜成纖維細(xì)胞抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］．眼科，2002，1l(1):37-40．

［5］ 高 于，吳鳴建，胡殿麗，等．木蝴蝶揮發(fā)油提取工藝優(yōu)化及動力學(xué)模型研究［J］．應(yīng)用化工，2008，37(1):11-13．

［6］ 苑立博，馬 麗，盧 奎．微波輔助法提取桃仁油的工藝研究［J］．河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然版，2007，28(4):45-47．

［7］ 張 力，趙明威，黎曉新．影響光動力療法治療脈絡(luò)膜新生血管視力預(yù)后的多因素分析［J］．中華眼底病雜志，2004，20(5):292-294．

［8］ 朱 潔，王雨生，惠延年．脈絡(luò)膜新生血管的生成和抑制［J］．眼科新進(jìn)展，2004，24(1):57-60．

The inhibition effects of Oroxylum indicum extract on the experimental choroidal neovascularization
ZHENG Jin-hua

(Ophthalmology Department，Hospital Affiliated to Guiyang Medical College，Guiyang 550004，China)

R285．5

A

1005-1678(2012)06-0843-03

2012-07-18

鄭金華，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事眼科角膜病方面的研究與治療，E-mail:zhengjinhua_gy@163．com。