李 炎，晁若冰，林 濤，王叔橋

(1．四川省食品藥品檢驗(yàn)所，四川 成都610097;2．四川大學(xué) 華西藥學(xué)院，四川 成都 610041)

頂空氣相色譜法測定彈性酶中有機(jī)溶劑殘留量

李 炎1，2，晁若冰2，林 濤1，王叔橋1

(1．四川省食品藥品檢驗(yàn)所，四川 成都610097;2．四川大學(xué) 華西藥學(xué)院，四川 成都 610041)

目的 建立彈性酶原料中4種有機(jī)溶劑殘留量的測定方法。方法 采用頂空氣相色譜法，F(xiàn)ID檢測器，分別在系統(tǒng)一:FFAP毛細(xì)管柱(30 m×0．32 mm，1．8 μm)，程序升溫(80℃保持15 min，以30℃/min升至220℃，保持5 min);系統(tǒng)二:DB-624毛細(xì)管柱(30 m×0．32 mm，1．8 μm)，程序升溫(40℃保持8 min，以30 ℃/min升至220℃，保持5 min);頂空條件均為85℃平衡30 min，進(jìn)樣口溫度均為250℃，檢測器溫度均為250℃，載氣為氮?dú)?，以水為溶劑配制對照品溶液及樣品溶液，采用外?biāo)法定量。結(jié)果 4種殘留溶劑在對應(yīng)于限度的50% ～150%濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系(r=0．996 6～0．999 5)，平均回收率為92．1% ～103．3%。結(jié)論 該法簡便快捷，能準(zhǔn)確有效地控制產(chǎn)品的質(zhì)量。

彈性酶;頂空氣相色譜法;乙酸;乙醇;乙醚;丙酮

彈性酶(elastase)是由豬胰臟提取或由微生物經(jīng)發(fā)酵而制得的能溶解彈性蛋白的酶，是由240個氨基酸組成的多肽，分子質(zhì)量為25 900。本品能影響脂代謝，阻止膽固醇在體內(nèi)的合成并促進(jìn)其轉(zhuǎn)化為膽汁酸，從而降低血清膽固醇，并有防止動脈粥樣硬化及抗脂肪肝作用［1］。彈性酶主要由豬胰臟經(jīng)色譜、鹽析等步驟分離制備，在純化階段，主要用到的有機(jī)溶劑為乙酸、乙醇、乙醚、丙酮，參照《中國藥典》2010年版二部附錄ⅧP對殘留溶劑檢查規(guī)定，均為三類控制溶劑，限度值為0．5%［2］。目前，未見國內(nèi)有彈性酶中乙酸等4種溶劑殘留量檢測的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究根據(jù)殘留溶劑的特性將這4種溶劑分為兩組分別測定:第一組為乙酸;第二組為乙醇、乙醚和丙酮。

1 儀器與試藥

Agilent GC 6890N;Agilent自動頂空進(jìn)樣器G1888;氫氣發(fā)生器;FID檢測器;Sartorius BP211D電子天平;Chemstation色譜工作站。

色譜柱:鍵合和改性的交聯(lián)聚乙二醇為固定液的Agilent FFAP 柱(30 m ×0．32 mm，1．80 μm;6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷(或極性相似)為固定液的 Agilent DB-624 柱(30 m ×0．32 mm，1．80 μm)。

乙酸(色譜純)，TEMED公司;丙酮(優(yōu)級純)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;乙醇、乙醚(色譜純)，F(xiàn)isher公司;水為超純水。

彈性酶(批號:100304，100305，100306)，四川順生制藥有限公司。

2 方法與結(jié)果

2．1 頂空進(jìn)樣條件

頂空瓶平衡溫度:85℃，平衡時(shí)間:30 min，傳輸線溫度:105℃。

2．2 色譜條件

系統(tǒng)一:FFAP柱，程序升溫:起始溫度80℃，保持15 min，以30℃/min升至220℃，保持5 min;系統(tǒng)二:DB-624柱，程序升溫:起始溫度40℃，保持8 min，以30℃/min升至220℃，保持5 min;載氣為氮?dú)?柱流速為2 mL/min;分流比為5∶1;進(jìn)樣口溫度為250℃;檢測器(FID)溫度為250℃。

2．3 對照品溶液的制備

取乙酸適量，用水配制成0．5 mg/mL的對照品溶液。同法制備含乙醇、乙醚、丙酮均為0．5 mg/mL的混合對照品溶液。

2．4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別精密量取乙酸對照品溶液、混合對照品溶液各1 mL，置20 mL頂空瓶中，加水1 mL，加蓋，密封，頂空進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。同時(shí)取供試品0．1 g，加水2 mL，同法測定。結(jié)果乙酸、乙醇、乙醚、丙酮理論板數(shù)分別為 54 098，47 876，45 924，48 429;系統(tǒng)二中乙醚、丙酮的分離度分別為1．82和6．15。系統(tǒng)一色譜圖見圖1，系統(tǒng)二色譜圖見圖2。

圖1 對照品(A)和供試品(B)氣相色譜圖(系統(tǒng)一)

2．5 精密度

2．5．1 日內(nèi)精密度 分別精密量取乙酸對照品溶液和混合對照品溶液各1 mL，置20 mL頂空瓶中，加水1mL，壓蓋，密封，平行制備5瓶，于24h內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣測定5次，記錄色譜圖，乙酸、乙醇、乙醚、丙酮峰面積 RSD(n=5)分別為 2．02%，1．00%，1．20%，2．54%。

圖2 對照品(A)和供試品(B)氣相色譜圖(系統(tǒng)二)

2．5．2 日間精密度 分別精密量取乙酸對照品溶液和混合對照品溶液各1 mL，置20 mL頂空瓶中，加水1 mL，壓蓋，密封，平行制備5瓶，記錄色譜圖，每天一次，考察5 d，乙酸、乙醇、乙醚、丙酮峰面積RSD(n=5)分別為2．12%，1．30%，2．00%，1．34%。

2．6 檢測限和定量限

分別精密量取乙酸對照品溶液和混合對照品溶液適量，加水逐級稀釋至一定濃度后，精密量取2 mL，置20 mL頂空瓶中，壓蓋，密封，進(jìn)樣測定。按S/N為3時(shí)，即為其最低檢測限;按S/N為10時(shí)，即為其最低定量限。結(jié)果乙酸、乙醇、乙醚、丙酮的檢出限分別為 0．000 061%，0．000 043%，0．000 003 7%，0．000 026%，定量限分別為 0．000 20%，0．000 14%，0．000 012%，0．000 088%。

2．7 線性試驗(yàn)

分別精密量取乙酸對照品溶液和混合對照品溶液適量，加水依次稀釋成含乙酸 253．9，406．2，507．8，609．4，761．7 μg/mL，含乙醇 250．3，400．5，500．6，600．7，750．9 μg/mL，含乙醚 253．7，405．9，507．4，608．9，761．1 μg/mL，含丙酮 254．5，407．2，509．0，610．8，763．5 μg/mL 的溶液，分別精密量取1 mL，置20 mL頂空瓶中，加水1 mL，壓蓋，密封，進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表3。結(jié)果表明乙酸、乙醇、乙醚、丙酮在《中國藥典》2010年版給出的限度的50%～150%范圍內(nèi)與相對應(yīng)的峰面積線性關(guān)系良好。

表3 殘留溶劑線性回歸方程

2．8 回收率試驗(yàn)

取樣品約0．1 g，精密稱定，平行9份，分別置20 mL頂空瓶中，加水 1 mL，再精密加入 0．4(80%)，0．5(100%)，0．6(120%)mg/mL 乙酸對照品溶液1 mL，每個濃度平行3份，加蓋，密封，測定。同時(shí)制備樣品溶液，同法測定，扣除樣品中相對應(yīng)的殘留溶劑峰面積，計(jì)算回收率。同法測定乙醇、乙醚、丙酮。結(jié)果乙酸、乙醇、乙醚、丙酮的平均回收率分別為 99．8%，97．8%，102．3% 和 103．7%，其對應(yīng)的 RSD(n=9)依次為4．7%，3．3%，2．0%和2．3%。

2．9 樣品測定

分別精密稱取三批樣品各0．1 g，置20 mL頂空瓶中，加水2 mL，同時(shí)精密量取2．3項(xiàng)下各對照品溶液1 mL，加水1 mL，加蓋，密封，分別在系統(tǒng)一、系統(tǒng)二下頂空進(jìn)樣測定，按外標(biāo)法計(jì)算各殘留溶劑的含量，結(jié)果見表4。

表4 樣品測定結(jié)果

由表4可見，三批樣品的測定結(jié)果均小于中國藥典2010年版二部規(guī)定的限度(不超過0．5%)要求。

3 討論

乙酸與乙醇、乙醚、丙酮的極性相差太遠(yuǎn)，在同一系統(tǒng)下很難做到4個組分的峰對稱性、分離度等均達(dá)到要求，故采取兩個色譜系統(tǒng)測定。同時(shí)，由于乙酸的沸點(diǎn)高，在頂空氣相色譜中響應(yīng)值太低，故實(shí)驗(yàn)中測定乙酸的RSD相對偏高。

進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗(yàn)時(shí)，色譜圖中相鄰峰的分離度均大于2．0，理論板數(shù)均大于45 000，表明在兩個系統(tǒng)下分別測定乙酸、乙醇、乙醚、丙酮，能符合中國藥典2010年版二部附錄ⅧP殘留溶劑的規(guī)定。

在樣品色譜圖中，在非乙酸、乙醇、乙醚、丙酮保留時(shí)間外，出現(xiàn)了其他峰，但是不干擾這4種殘留溶劑檢測，另外由于彈性酶生產(chǎn)工藝中最后精制等關(guān)鍵步驟中未涉及到其他有機(jī)溶劑，因此未對色譜圖中其他雜質(zhì)進(jìn)行分析。

［1］ 吳梧桐．酶類藥物學(xué)［M］．北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2011:472-476．

［2］ 中國藥典［S］．二部．2010:附錄Ⅷ P．

Determination of residual organic solvents in elastase by headspace gas chromatography

LI Yan1，2，CHAO Ruo-bing2，LIN Tao1，WANG Shu-qiao1
(1．Sichuan Institute for Food and Drug Control，Chengdu 610097，China;2．West China School of Pharmacy，Sichuan University，Chengdu 610041，China)

Purpose To establish the methods for determination of four kinds of residual organic solvents in elastase．Methods Capillary column was used with temperature program and FID detector by headspace at injection temperature of 85 ℃ and equilibrium 30 min，using nitrogen as the carrying gas．The first system:FFAP capillary column(30 m ×0．32 mm，1．8 μm)．The column temperature was initially maintained at 80℃ for 15 min，then increased to 220℃ at the rate of 30℃ per min and maintained for 5 min．The second system:DB-624 capillary column(30 m ×0．32 mm，1．8 μm)．The column temperature was initially maintained at 40℃for 8 min，then increased to 220℃at the rate of 30℃per min and maintained for 5 min．The injector temperature was maintained at 250 ℃ and the detector temperature was 250 ℃．Results The recoveries were 92．1%-103．3%and excellent linearity was obtained(r=0．996 6-0．999 5)between the corresponding concentrations of 50%limits and 150%limits．Conclusion The method was sensitive，accurate，rapid and suitable for quality control．

elastase;HS-GC;acetic acid;ethanol;ether;acetone

R927．11

A

1005-1678(2012)06-0824-03

2012-02-28

李 炎，男，藥物分析專業(yè)碩士研究生，Tel:028-87877146，E-mail:liyanner@sina．com;晁若冰，女，通信作者，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向:藥品質(zhì)量評價(jià)與控制，Email:rbchao@scu．edu．cn。