賈 瑞，賀艷麗

(1．山東大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012;2．山東省生物藥物研究院 博士后科研工作站，山東 濟(jì)南250101)

聚季銨鹽-1的抑菌活性及其穩(wěn)定性研究

賈 瑞1，2，賀艷麗1，2

(1．山東大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012;2．山東省生物藥物研究院 博士后科研工作站，山東 濟(jì)南250101)

目的 研究聚季銨鹽-1的抑菌活性及其穩(wěn)定性。方法 采用營養(yǎng)肉湯試管二倍稀釋法測定聚季銨鹽-1對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌和黑曲霉的最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)，并研究紫外光照射、溫度、pH和鹽濃度對(duì)聚季銨鹽-1穩(wěn)定性的影響。結(jié)果 聚季銨鹽-1對(duì)5種試驗(yàn)菌的MIC 依次為16，4，16，8，64 μg/mL;對(duì)5 種試驗(yàn)菌的 MBC 依次為16，8，32，8，128 μg/mL。聚季銨鹽-1 的抑菌活性不受紫外光和pH的影響，但會(huì)隨溫度和鹽濃度的升高而降低。結(jié)論 聚季銨鹽-1在較低濃度具有抑制微生物生長的活性，對(duì)紫外照射和pH較穩(wěn)定，高溫易使其分解，在高滲環(huán)境下，其抑菌活性也會(huì)顯著降低。

聚季銨鹽-1;抑菌活性;最低抑菌濃度;穩(wěn)定性

自1935年德國Domark發(fā)現(xiàn)烷基二甲基芐基氯化銨(苯扎氯銨)的殺菌作用并利用其處理軍服以防止傷口感染以來，季銨鹽類抗菌劑的研究一直是研究者關(guān)注的重點(diǎn)，用于抑菌的季銨鹽類陽離子表面活性劑新品種陸續(xù)問世［1］。聚季銨鹽-1(polyquaternium-1，PQ-1)是一種新型的季銨鹽類抑菌劑，具有抑菌作用強(qiáng)、毒副作用輕、使用濃度低的特點(diǎn)，作為溫和型抑菌劑在藥物制劑防腐等領(lǐng)域已得到較為廣泛的研究和應(yīng)用［2］。PQ-1用作眼用制劑抑菌劑，對(duì)角膜沒有毒性，不影響角膜上皮細(xì)胞的正常生長，是較為理想的眼用制劑抑菌劑，其常用的質(zhì)量濃度為0．01 g/L［3］。目前，愛爾康公司出品的“淚然”滴眼液中，就選用了PQ-1作為抑菌劑。

本研究考察了PQ-1對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌和黑曲霉等5種常見致病菌的抑菌活性以及不同處理?xiàng)l件對(duì)其抑菌活性穩(wěn)定性的影響，為將來更好地利用和開發(fā)PQ-1抑菌劑提供思路和數(shù)據(jù)支持。

1 材料

29．2%PQ-1 樣品(Mw為 22 103，山東博士倫福瑞達(dá)制藥有限公司研發(fā)部實(shí)驗(yàn)室提供);大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉(山東博士倫福瑞達(dá)制藥有限公司微生物實(shí)驗(yàn)室提供);營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司);其他試劑均為分析純。

AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司);METTLER TOLEDO 320型pH計(jì)(上海艾測電子科技有限公司);超凈工作臺(tái)(濟(jì)南潔康空氣凈化設(shè)備廠);SPX-150型生化培養(yǎng)箱(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)。

2 方法

2．1 菌懸液和樣品溶液的制備

取于37℃分別培養(yǎng)24 h的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌及20～25℃培養(yǎng)48 h的白色念珠菌新鮮培養(yǎng)物，用適量無菌生理鹽水洗脫制成菌懸液，然后將菌懸液用無菌生理鹽水稀釋為濃度108cfu/mL，備用。取20～25℃條件下培養(yǎng)6～10 d的黑曲霉新鮮培養(yǎng)物，用適量含聚山梨酯80的無菌生理鹽水洗脫孢子，必要時(shí)用紗布過濾，然后用無菌生理鹽水稀釋至濃度108cfu/mL，備用。

取上述菌液各0．1 mL，分別加入到無菌生理鹽水10 mL中，使最終菌液濃度約為106cfu/mL，備用。

分別精密稱取PQ-1適量，配成濃度為1 280和1 000 μg/mL 的 PQ-1 溶液，備用。

2．2 最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)測定

MIC采用營養(yǎng)肉湯稀釋法［4］(試管二倍稀釋法)測定。第1管加入營養(yǎng)肉湯1．6 mL，其余各管加入營養(yǎng)肉湯1 mL，在第1管加入PQ-1溶液(1 280 μg/mL)0．4 mL混勻，然后吸取1 mL至第2管，混勻后再吸取1 mL至第3管，如此連續(xù)倍比稀釋至第7管，混勻后取出1 mL棄去，第8管不加樣品液作為對(duì)照。然后各管均加入106cfu/mL菌懸液1 mL，搖勻，使每管最終菌液濃度約為5×105cfu/mL。置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18 h，觀察結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果評(píng)判［5］:當(dāng)對(duì)照管有細(xì)菌生長(渾濁)時(shí)，試驗(yàn)組無菌生長(澄清)的最高稀釋度所對(duì)應(yīng)的抑菌劑濃度，為該樣品對(duì)受試菌的MIC。

MBC為殺死99．9%(降低3個(gè)數(shù)量級(jí))的供試微生物所需的最低藥物濃度［6］。從MIC測試的沒有明顯渾濁的管中取樣品液50 μL，涂布在新鮮的營養(yǎng)瓊脂平板中，然后于37℃培養(yǎng)24 h，計(jì)菌落數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果評(píng)判［6］:計(jì)算沒有出現(xiàn)明顯渾濁的管中菌數(shù)相對(duì)于初始菌數(shù)變化的對(duì)數(shù)值，以相對(duì)初始菌數(shù)下降3個(gè)對(duì)數(shù)值所對(duì)應(yīng)的抑菌劑濃度為該樣品對(duì)受試菌的MBC。

2．3 PQ-1抑菌活性穩(wěn)定性研究

以金黃色葡萄球菌為指示菌，考察了不同處理?xiàng)l件對(duì)PQ-1抑菌活性的影響。

2．3．1 紫外照射的影響 將0．01%PQ-1溶液分別在紫外燈下照射 0，5，15，20，25 和 30 min。取不同處理時(shí)間的PQ-1樣品溶液1 mL分別加入營養(yǎng)肉湯9 mL，然后分別加入108cfu/mL菌懸液0．1 mL，搖勻，同時(shí)以不加樣品溶液的試管作為空白對(duì)照。37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18 h，按活菌計(jì)數(shù)法計(jì)算各管中的菌數(shù)，通過計(jì)算各處理組相對(duì)空白對(duì)照組菌數(shù)的對(duì)數(shù)變化值(Logarithmic Difference in Population，LogDP)以檢測其抑菌活性的變化，計(jì)算公式為:LogDP=LogN0－LogN，N0為空白對(duì)照組的菌數(shù)，N為各處理組的菌數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2．3．2 溫度的影響 將0．01%PQ-1溶液分別置于20，60和100℃水浴和121℃濕熱條件下各處理30 min，然后立刻放置冰浴中迅速冷卻，按2．3．1項(xiàng)下方法檢測其抑菌活性。

2．3．3 鹽濃度的影響 配制含 NaCl分別為0，1%，3%，5%，7%和 9%的培養(yǎng)基，按 2．3．1 項(xiàng)下方法檢測0．01%PQ-1溶液在各培養(yǎng)基中的抑菌活性。

2．3．4 pH的影響 取PQ-1溶液，用不同pH值的磷酸鹽緩沖液將其稀釋成濃度為0．01%的溶液，使各溶液 pH 值分別為 4．0，7．0，10．0，12．0，并以不同pH值的緩沖溶液作為陽性對(duì)照，按2．3．1項(xiàng)下方法檢測其抑菌活性。

3 結(jié)果與討論

3．1 PQ-1對(duì)5種致病菌的MIC和MBC

試驗(yàn)結(jié)果表明，PQ-1對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌和黑曲霉的MIC分別為 16，4，16，8 和 64 μg/mL;MBC 分別為 16，8，32，8 和 128 μg/mL。

3．2 PQ-1抑菌活性穩(wěn)定性研究

3．2．1 紫外照射的影響 結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，隨著紫外光照射時(shí)間的變化，PQ-1的抑菌活性基本保持不變，由此可知，PQ-1對(duì)紫外光照射具有較好的穩(wěn)定性。

3．2．2 溫度的影響 結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，隨著溫度的升高，PQ-1的抑菌活性呈下降趨勢，經(jīng)121℃濕熱處理30 min后其抑菌活性基本喪失。由此可知，PQ-1對(duì)熱不穩(wěn)定，以其作為抑菌劑的藥物制劑不宜采用濕熱滅菌。

圖1 紫外照射對(duì)抑菌活性的影響Fig．1 Influence of UV irradiation on bacteriostatic activity

圖2 溫度對(duì)抑菌活性的影響Fig．2 Influence of temperature on bacteriostatic activity

3．2．3 鹽濃度的影響 結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，NaCl濃度為1%時(shí)，PQ-1的抑菌活性最好，體系中NaCl濃度增加會(huì)降低PQ-1的抑菌活性。

圖3 鹽濃度對(duì)抑菌活性的影響Fig．3 Influence of salt concentration on bacteriostatic activity

3．2．4 pH的影響 結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，pH值在4．0～12．0范圍內(nèi)，PQ-1的抑菌活性基本上穩(wěn)定，變化不大，這說明PQ-1的抑菌活性基本上不受pH值的影響。

圖4 pH對(duì)抑菌活性的影響Fig．4 Influence of pH on bacteriostatic activity

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PQ-1對(duì)該5種試驗(yàn)菌均有不同程度的抑菌效果，其中對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，對(duì)黑曲霉的抑菌效果相對(duì)較差。

紫外光照射和pH值對(duì)PQ-1的抑菌活性沒有顯著的影響，但隨著處理溫度的升高，抑菌活性呈下降趨勢，因此，在使用過程中應(yīng)盡量避免加熱。體系中NaCl濃度為1%時(shí)，PQ-1的抑菌活性最好，這可能與其抑菌機(jī)制有關(guān)。Codling等［7］的研究結(jié)果表明，PQ-1抑菌作用的靶點(diǎn)是菌體細(xì)胞膜，在生理鹽濃度體系中，菌體細(xì)胞形態(tài)最好，這有利于PQ-1穿透細(xì)胞壁，與細(xì)胞膜結(jié)合，從而發(fā)揮抑菌作用。

隨著PQ-1專利的過期，PQ-1作為溫和型抑菌劑正逐漸得到廣泛的研究和應(yīng)用。我國在藥用抑菌劑方面較為落后，選擇范圍小。本實(shí)驗(yàn)為更好地利用和開發(fā)PQ-1提供了數(shù)據(jù)支持。

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Study on bacteriostatic activity and stability of polyquaternium-1

JIA Rui1，2，HE Yan-li1，2
(1．School of Pharmaceutical Science，Shandong University，Jinan 250012，China;2．Postdoctoral Scientific Research Workstation，Institute of Biopharmaceuticals of Shandong Province，Jinan 250101，China)

Purpose To study the bacteriostatic activity and stability of polyquaternium-1(PQ-1)．Methods The minimal inhibitory concentration(MIC)and minimal bactericidal concentration(MBC)of PQ-1 to Escherichia coli，Staphyloccocus aureus，Pseudomonas aeruginosa，Candida albicans and Aspergillus niger were determined through double broth dilution method．The effects of UV irradiation，temperature，pH and salt concentration on stability of PQ-1 were also evaluated．Results The MIC of PQ-1 to the test microbes were 16，4，16，8 and 64 μg/mL respectively，and the MBC were 16，8，32，8 and 128 μg/mL respectively．The bacteriostatic activity of PQ-1 was not affected by UV irradiation and pH，but decreased with the rise of temperature and salt concentration．Conclusion PQ-1 with low concentration displayed the strong bacteriostatic activities．And it was relatively stable to UV irradiation and pH．However，it was heatsensitive and easily deactivated in hyperosmotic salt solution．

polyquaternium-1;bacteriostatic activity;minimal inhibitory concentration;stability

R962;R927．11

A

1005-1678(2012)06-0782-04

2012-03-09

賈 瑞，男，碩士研究生，微生物與生化藥學(xué)專業(yè);賀艷麗，女，通信作者，研究員，E-mail:yanli．he@bausch．com。