宮 亮，李 里，陳 冬

(遼寧醫(yī)學(xué)院 附屬第一醫(yī)院 1．耳鼻咽喉科，2．兒科，遼寧 錦州 121000)

Wnt 通路對胰島素樣生長因子-1抑制小鼠毛細(xì)胞凋亡的作用

宮 亮1，李 里2，陳 冬1

(遼寧醫(yī)學(xué)院 附屬第一醫(yī)院 1．耳鼻咽喉科，2．兒科，遼寧 錦州 121000)

目的 探討胰島素樣生長因子-1(IGF-1)抑制小鼠毛細(xì)胞凋亡作用的調(diào)控機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)新生小鼠耳蝸基底膜。在分別含有正常對照培養(yǎng)液(A組)、0．5 mmol/L慶大霉素(GM)(B組)、0．5 mmol/L GM+1 ng/mL IGF(C 組)、0．5 mmol/L GM+1 ng/mL IGF+5 μg/mL wif(D 組)、0．5 mmol/L GM+1 ng/mL IGF+10 μg/mL wif(E組)、0．5 mmol/L GM+1 ng/mL IGF+15 μg/mL wif(F組)的成分中培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞及固定。應(yīng)用TUNEL法觀察各組耳蝸毛細(xì)胞的凋亡情況。應(yīng)用Western blot及Real-time PCR法觀察Caspase-3的表達(dá)情況。結(jié)果 B組耳蝸毛細(xì)胞經(jīng)刺激后，細(xì)胞凋亡數(shù)量及Caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)較A組明顯上升(P＜0．01)，C組耳蝸毛細(xì)胞經(jīng)IGF刺激后，細(xì)胞凋亡數(shù)量及Caspase-3mRNA和蛋白表達(dá)較B組明顯下降(P＜0．01)，應(yīng)用Wnt阻斷劑(wif)后D、E及F組細(xì)胞凋亡數(shù)量及Caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)較C組升高，其中F組升高顯著(P＜0．01)。結(jié)論 IGF可能通過激活Wnt通路抑制毛細(xì)胞凋亡。

胰島素樣生長因子-1;Caspase-3;毛細(xì)胞;凋亡

胰島素樣生長因子-1(IGF-1)是在動(dòng)物體內(nèi)存在的一種生長因子，調(diào)控耳蝸生長發(fā)育及細(xì)胞間協(xié)調(diào)穩(wěn)定。近些年對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)治療研究中各種神經(jīng)營養(yǎng)因子都進(jìn)行了廣泛研究［1-2］，雖然IGF-1在神經(jīng)細(xì)胞損傷防護(hù)中已得到廣泛應(yīng)用，但在耳蝸發(fā)育中的變化以及對耳蝸毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的保護(hù)作用及作用機(jī)制尚不完全明確。本研究應(yīng)用慶大霉素(GM)建立藥物性耳聾損傷模型，研究IGF-1抑制耳蝸細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制，探討IGF-1在藥物性耳聾防治中的作用。

1 材料

胎牛血清及DMEM培養(yǎng)基購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(American Type Culture Collect ion，ATCC);IGF-1由美國Genentech公司惠贈(zèng);wif(Wnt抑制因子)購自美國Santa Cruz公司;Real-time PCR試劑盒購自美國Qiagen公司;抗Caspase-3抗體及二抗購自美國Santa Cruz公司;TUNEL檢測試劑盒購自美國Clontech公司。

MRC-1024激光共聚焦顯微鏡(BioRad，Watford，UK)。

2 方法

2．1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

取新生小鼠(4 d)耳蝸基底膜進(jìn)行離體培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液［3］。共分為6組:正常對照培養(yǎng)液［3］組(A 組)、0．5 mmol/L GM(B 組)、0．5 mmol/L GM+1 ng/mL IGF(C 組)、0．5 mmol/L GM+1 ng/mL IGF+5 μg/mL wif(D 組)、0．5 mmol/L GM+1 ng/mL IGF+10 μg/mL wif(E 組)以及 0．5 mmol/L GM+1 ng/mL IGF+15 μg/mL wif(F 組)，每組8 個(gè)樣本。加藥處理48 h后收集細(xì)胞。

2．2 觀察指標(biāo)及方法

2．2．1 TUNEL染色檢測耳蝸毛細(xì)胞凋亡 制作各組耳蝸組織鋪片;加用熒光素(FITC)標(biāo)記的核苷酸和脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶混合液;陰性對照為省去TUNEL的反應(yīng)液。對耳蝸基底膜細(xì)胞系進(jìn)行TUNEL染色，經(jīng)4%多聚甲醛固定后，置穿透液中，4℃，2 min，以核陽性作為結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)。激光共聚焦顯微鏡下觀察。

2．2．2 激光共聚焦顯微鏡觀察 用相應(yīng)波長激光激發(fā)后(FITC為514 nm，Cy3為554 nm，Cy5為610 nm)在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

2．2．3 Caspase-3蛋白和基因表達(dá)檢測 采用Western blot技術(shù)檢測腦白質(zhì)Caspase-3蛋白的表達(dá):將總蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后(每一樣本均含總蛋白60 μg)，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測Caspase-3的表達(dá)。所用抗體為羊抗Caspase-3及辣根過氧化物酶標(biāo)記的馬抗羊抗體。采用HPlsA 1000圖文分析系統(tǒng)分析膠片，用Caspase-3的灰度值表示Caspase-3的相對表達(dá)水平。

采用Real-time PCR技術(shù)檢測Caspase-3 mRNA的表達(dá)。參照Trizol說明書操作。采用Access RT PCR系統(tǒng)(Promega公司)將由腦白質(zhì)提取的總RNA 1 μg一步法擴(kuò)增成DNA目的片段。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為:48℃ 45 min;94℃ 2 min;94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 60 s，共35個(gè)循環(huán);72℃ 10 min;4℃保存。Caspase-3引物序列:上游序列為 5'GAATCCACGAGCAGAGTCAA 3'，下游序列為 5'AAGCCAACCAAGTTCAAGTTCACACA 3'，目的片段為205 bp;內(nèi)參照 β-actin上游序列為5'ACGTTGACATCCGTAAAGAC 3'，下游序列為 5'GAAGGTGGACAGTGAGGC 3'，目的片段為200 bp。用Caspase-3與β-actin的灰度比值表示Caspase-3的相對表達(dá)水平。

2．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3．1 激光共聚焦顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞

觀察結(jié)果見圖1。激光共聚焦顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞為紅色。A組未檢測到凋亡細(xì)胞;B組加入GM后，凋亡細(xì)胞明顯增多;C組將GM及IGF1共同加入后細(xì)胞凋亡明顯減少;應(yīng)用Wnt阻斷劑wif后，凋亡細(xì)胞較未加入wif明顯增加，其中F組凋亡細(xì)胞增加明顯。

3．2 耳蝸毛細(xì)胞Caspase-3蛋白及mRNA相對表達(dá)量

圖1 各組凋亡細(xì)胞觀察結(jié)果

加藥處理48 h后，Caspase-3蛋白及mRNA表達(dá)，B組較A組明顯增高(P＜0．01);C組較B組明顯減少(P＜0．05);E和F組較C組明顯增高(P＜0．01 或0．05)。Western blot結(jié)果及 Real-time PCR結(jié)果分別見圖2和表1。

圖2 加藥48 h后各組Caspase-3蛋白表達(dá)

表1 Caspase-3蛋白及mRNA相對表達(dá)量(n=8，x±s)

4 討論

耳蝸毛細(xì)胞是重要的感音細(xì)胞，聽發(fā)育期毛細(xì)胞數(shù)量減少或功能損傷可引起成年后機(jī)體聽力損傷。耳蝸毛細(xì)胞凋亡是聽力功能下降的主要原因［4］。IGF-1是一種含70個(gè)氨基酸的單鏈多肽是一種內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，有研究表明，敲除IGF-1基因的鼠在內(nèi)耳發(fā)育期出現(xiàn)內(nèi)耳細(xì)胞凋亡，而且出現(xiàn)聽力減退，提示IGF-1對內(nèi)耳毛細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)有一定的影響［5-6］。Lakhani等［7］研究表明，IGF-1 可以保護(hù)耳蝸毛細(xì)胞免于凋亡。本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)［3］，IGF-1能夠抑制GM誘導(dǎo)離體培養(yǎng)的小鼠耳蝸毛細(xì)胞凋亡的發(fā)生，對耳蝸毛細(xì)胞有保護(hù)作用，但這一保護(hù)作用的精確分子機(jī)制目前尚不清楚。

耳蝸毛細(xì)胞在耳蝸的形成、發(fā)育、修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用。Wnt/β-catenin信號通路在耳蝸毛細(xì)胞的分化、增殖及凋亡過程中發(fā)揮著重要的作用。Wnt/β-catenin信號通路與其他途徑及蛋白相互協(xié)調(diào)作用于耳蝸組織［8］。IGF-1是耳蝸形成的調(diào)節(jié)因子，具有促進(jìn)有絲分裂等作用，在耳蝸形成過程中發(fā)揮了重要的生理作用。在IGF-1抑制耳蝸毛細(xì)胞凋亡的過程中，Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是否參與其作用尚不清楚。為進(jìn)一步明確IGF-1對小鼠耳蝸毛細(xì)胞凋亡的影響及Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在該過程中的作用，實(shí)驗(yàn)以IGF-1及GM聯(lián)合作用于小鼠耳蝸毛細(xì)胞，探討IGF-1對耳蝸細(xì)胞凋亡的影響及在此過程中阻斷Wnt/β-catenin信號通路對耳蝸毛細(xì)胞凋亡的影響。本文應(yīng)用Wnt通路阻斷劑wif阻斷Wnt通路觀察耳蝸毛細(xì)胞凋亡的情況。

本研究結(jié)果表明，與A組相比，B組凋亡細(xì)胞明顯增加，表明GM誘導(dǎo)耳蝸毛細(xì)胞凋亡導(dǎo)致耳蝸毛細(xì)胞損傷。與B組相比，加入IGF-1后，凋亡毛細(xì)胞明顯減少，說明IGF-1可以抑制毛細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)前期工作已經(jīng)證實(shí)在不同時(shí)間點(diǎn)不同劑量的應(yīng)用IGF-1可以抑制毛細(xì)胞凋亡。將Wnt通路阻斷劑加入耳蝸毛細(xì)胞后與C組比較，E和F組毛細(xì)胞凋亡率明顯增高，表明將Wnt通路阻斷后抑制了IGF-1的抗凋亡作用，說明IGF-1的抗凋亡作用可能通過Wnt通路調(diào)節(jié)。

本研究應(yīng)用Wnt通路阻斷劑wif后耳蝸毛細(xì)胞中Caspase-3蛋白和基因表達(dá)較僅應(yīng)用IGF-1組明顯增加，表明阻斷Wnt通路后，IGF-1的抗凋亡作用受到抑制，推測IGF-1的抗凋亡作用可能通過Wnt通路調(diào)節(jié)。其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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The effect of Wnt pathway on antiapoptosis activity by Insulin-like Growth Factor-1 in cochlear hair cells in rat

GONG Liang1，LI Li2，CHEN Dong1
(1．ENT Department，2．Pediatric Department，the No．1 Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China)

Purpose To investigate the gene regulation mechanism of Insulin-like Growth Factor-1(IGF-1)antiapoptosis activity on rat hair cells．Methods Basilar membrane of cochlea of newly born mice were cultured in vitro in six group:control culture solution(group A)，0．5 mmol/L GM(gentamicin)(group B)，0．5 mmol/L GM+1 ng/mL IGF-1(group C)，0．5 mmol/L GM+1 ng/mL IGF-1+5 μg/mL wif(group D)，0．5 mmol/L GM+1 ng/mL IGF-1+10 μg/mL wif(group E)，0．5 mmol/L GM+1 ng/mL IGF-1+15 μg/mL wif(group F)．After cultured，cochlear preparation were made by used TUNEL method，the apoptosis of cochlear hair cells was observed with laser scanning confocal microscope．Caspase-3 protein and m RNA was examed by western blot and real-time PCR．Results There was no apoptosis cell labeled by TUNEL in basilar membrane in group A．Apoptosis cells labeled by TUNEL in basal，in group B，was higher than that in group A(P ＜0．05)．Apoptosis cells in group C was lower than that in group B(P ＜0．05)．Apoptosis cells in group D，E，F(xiàn) were higher than that in group C，especialy in group F．The expression of Caspase-3 showed the same result．Conclusion Wntpathway plays an important role in the process of apoptosis in cochlear hair cells by IGF-1．

Insulin-Like Growth Factor-1;Caspase-3;hair cells;apoptosis

R961

A

1005-1678(2012)06-0766-03

2012-08-22

遼寧省教育廳高等學(xué)校科研項(xiàng)目(2009A460)

宮 亮，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事耳鼻咽喉科疾病的基礎(chǔ)和臨床，尤其是耳神經(jīng)外科及相關(guān)基礎(chǔ)研究;陳 冬，男，通信作者，副主任醫(yī)師，副教授，E-mail:entdoctorchen@163．com。