崔艷花，郭春梅，孫明忠，郭一萌，魚紅閃，劉淑清

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，遼寧 大連 116044;2.大連醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)系，遼寧 大連 116044;3.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034)

系列黃酮化合物與血清白蛋白結(jié)合及其結(jié)構(gòu)相關(guān)性

崔艷花1，郭春梅2，孫明忠2，郭一萌1，魚紅閃3，劉淑清1

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，遼寧 大連 116044;2.大連醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)系，遼寧 大連 116044;3.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034)

目的 比較具有不同取代基基團(tuán)的八種黃酮類化合物與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用及與其結(jié)構(gòu)的相關(guān)性。方法 基于黃酮化合物能夠猝滅色氨酸殘基的內(nèi)源性熒光，采用熒光光譜法研究黃酮類化合物與BSA結(jié)合作用，根據(jù)熒光猝滅方程計(jì)算黃酮類化合物與BSA的表觀結(jié)合常數(shù)(KA)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。結(jié)果 八種黃酮類植物化學(xué)物與BSA的結(jié)合強(qiáng)弱依次為:橙皮素(5.59×105)＞槲皮素(4.94×105)＞柚皮素(3.04×105)＞異槲皮素(4.66×104)＞淫羊藿苷(3.60×104)＞蘆丁(1.65×104)＞橙皮苷(2.50×103)＞柚皮苷(8.70×102)。結(jié)論 糖苷基取代對(duì)黃酮類化合物與BSA的結(jié)合作用有很大影響，A環(huán)可能是黃酮類化合物插入BSA疏水區(qū)的關(guān)鍵部位，其C7位上的糖苷基取代是影響其與BSA結(jié)合的關(guān)鍵基團(tuán)。此研究探討了黃酮類化合物與BSA的作用及其與結(jié)構(gòu)相關(guān)性規(guī)律，對(duì)了解黃酮類化合物在體內(nèi)的運(yùn)輸、代謝和分布提供了一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

黃酮類化合物;牛血清白蛋白;熒光光譜;結(jié)構(gòu)

血清白蛋白是血液中最為豐富的載體蛋白，具有儲(chǔ)運(yùn)內(nèi)源性代謝產(chǎn)物和外源性藥物小分子的作用，是藥物發(fā)揮藥效的重要載體和靶分子;藥物進(jìn)入血漿后與血清白蛋白結(jié)合，再被運(yùn)送到身體各部位而發(fā)揮藥效［1］。藥物與血清白蛋白相互作用的強(qiáng)弱決定著藥物作用強(qiáng)度、作用時(shí)間、清除速度及分布等［2-3］。因此研究藥物與血清白蛋白的相互作用對(duì)了解藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝過(guò)程、研究藥物與蛋白質(zhì)的相互作用機(jī)理、了解藥物發(fā)揮藥效的作用機(jī)制、預(yù)測(cè)藥物毒性劑量和不良反應(yīng)、揭示藥物藥效、對(duì)藥量調(diào)整、藥物改良和新藥研發(fā)等都具有重要借鑒意義［4-5］。牛血清白蛋白(BSA)與人血清白蛋白(HSA)具有相似的序列和構(gòu)型，所以BSA常被選為研究藥物與蛋白相互作用的首選底物。

黃酮類化合物是天然多酚類植物化學(xué)物，具有潛在治療癌癥、抗炎癥、抗自由基、抗氧化、抗病毒、調(diào)節(jié)血壓和血糖、防治心腦血管疾病等作用［6］。黃酮類化合物發(fā)揮藥效的目標(biāo)分子為蛋白質(zhì)，藥物活性高低取決于與靶向分子的相互作用、作用方式及親和力大小，而黃酮類化合物結(jié)構(gòu)上的差異常導(dǎo)致其生物學(xué)活性的變化［7-8］。目前，對(duì)黃酮類化合物構(gòu)效關(guān)系研究相對(duì)較少，其構(gòu)效關(guān)系對(duì)藥物的選用和開(kāi)發(fā)、作用機(jī)制的研究意義重要。

本文采用熒光光譜法分析了具有不同取代基基團(tuán)的八種黃酮類化合物，包括槲皮素、異槲皮素、蘆丁、橙皮素、橙皮苷、柚皮素、柚皮苷和淫羊藿苷(圖1)與BSA的表觀結(jié)合常數(shù)(KA)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n)，探討了該類化合物與BSA相互作用規(guī)律及與其結(jié)構(gòu)的關(guān)系。

圖1 八種黃酮類化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)圖Fig.1 The chemical structures of eight flavonoid phytochemicals

1 材料

槲皮素、異槲皮素、蘆丁、橙皮素、橙皮苷、柚皮素、柚皮苷和淫羊藿苷由大連工業(yè)大學(xué)提供;BSA(98%)購(gòu)于Acros公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

HITACHI 650-60熒光分光光度計(jì)，日本日立公司;Waters 2690/996高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司。

2 方法

2.1 八種黃酮類化合物純度分析

八種黃酮類化合物各0.55 mg，分別用甲醇2 mL溶解，0.2μm過(guò)濾器過(guò)濾后，分別取10μL進(jìn)樣，用高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)其純度。色譜條件:Intersil ODS-3 C18色譜柱(4.6 mm × 250 mm);流動(dòng)相:甲醇-0.2%磷酸溶液(60∶40);流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):槲皮素、異槲皮素、蘆丁、柚皮素、柚皮苷254 nm，橙皮素、橙皮苷283 nm，淫羊藿苷270 nm;柱溫:25℃。

2.2 八種黃酮類化合物與BSA的相互作用

八種黃酮類化合物分別用二甲亞砜(DMSO)配制成濃度為 2.65 ×10－4，2.59 ×10－4，2.07 ×10－4，2.59 × 10－4，2.07 × 10－4，2.59 × 10－4，2.07 × 10－4和2.07×10－4mol/L的儲(chǔ)備溶液，以 0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)將BSA配制成濃度為1×10－5mol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。在10 mL試管中加入1×10－5mol/L BSA溶液0.5 mL，再分別加入不同體積的黃酮類化合物，最后加0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)至5 mL，搖勻，將BSA濃度相同而黃酮類化合物濃度由低到高的一系列溶液在室溫下靜置1 h，然后測(cè)定樣品的熒光發(fā)射強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為346 nm，激發(fā)和發(fā)射光柵狹縫寬均為4 nm。

3 結(jié)果

3.1 八種黃酮類化合物純度分析

采用HPLC峰面積歸一法計(jì)算，得出槲皮素、蘆丁、異槲皮素、淫羊藿苷、橙皮素、橙皮苷、柚皮素和柚皮苷的純度分別為 98.22%，99.33%，97.12%，96.85%，95.85%，96.53%，95.64% 和 95.06%。用于BSA相互作用研究的這八種黃酮類化合物純度高，保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信性和準(zhǔn)確性。

3.2 八種黃酮類化合物與BSA相互作用

BSA分子中含有色氨酸、酪氨酸殘基，在280 nm激發(fā)下能產(chǎn)生較強(qiáng)的內(nèi)源熒光［4］。在保持BSA濃度固定不變的情況下，隨著黃酮類化合物濃度的增加，BSA的內(nèi)源性熒光有規(guī)律的降低;表明黃酮化合物與BSA相互作用，使BSA分子中能夠產(chǎn)生內(nèi)源性熒光的氨基酸殘基的微環(huán)境發(fā)生變化，而使BSA的內(nèi)源性熒光產(chǎn)生猝滅。

假設(shè)BSA與黃酮類化合物(D)與BSA(P)之間可以式(1)表達(dá):

式(1)中n是D在P上的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，KA為D與P的表觀結(jié)合常數(shù)。則KA可以式(2)表達(dá):

對(duì)式(2)做數(shù)學(xué)變換得到式(3):

由于黃酮類化合物與BSA結(jié)合后會(huì)發(fā)生熒光猝滅，假定DnP不發(fā)射熒光，則:

將(4)代入(3)得到猝滅方程式:

式(5)中［D］為黃酮化合物的濃度，I0為不加D的初始熒光強(qiáng)度，I為加入D后熒光強(qiáng)度?！鱅=I0－I。

以 lg［D］為橫坐標(biāo)，lg(△I/I)為縱坐標(biāo)作圖，得圖2。槲皮素、蘆丁、異槲皮素、淫羊藿苷、橙皮素、橙皮苷、柚皮素和柚皮苷分別在濃度為5.30×10－7～5.30 × 10－6，8.30 × 10－7～ 3.73 × 10－6，1.55 ×10－6～5.18 ×10－6，1.04 ×10－6～5.18 ×10－6，1.04×10－6～5.18 ×10－6，5.18 ×10－7～5.18 × 10－6，4.15 ×10－7～3.73 ×10－6和8.30 ×10－7～4.15 ×10－6mol/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系，根據(jù)其線性方程式即可得到各黃酮類化合物的KA和n。

槲皮素、蘆丁、異槲皮素、淫羊藿苷、橙皮素、橙皮苷、柚皮素和柚皮苷與BSA的結(jié)合位點(diǎn)n分別為0.97，0.86，0.92，0.95，1.08，0.74，1.06 和 0.63，八種黃酮類化合物與BSA的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)約為1，即在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，每個(gè)BSA約能與一分子的黃酮化合物結(jié)合。根據(jù)KA，八種黃酮類化合物與BSA結(jié)合的強(qiáng)弱順序?yàn)?橙皮素(5.59×105)＞槲皮素(4.94×105)＞柚皮素(3.04×105)＞異槲皮素(4.66×104)＞淫羊藿苷(3.60×104) ＞蘆丁(1.65×104)＞橙皮苷(2.50×103)＞柚皮苷(8.70×102)。構(gòu)效關(guān)系比較表明，糖苷基的取代與黃酮類化合物與BSA結(jié)合力強(qiáng)弱有密切關(guān)系。

圖2 八種黃酮類植物化學(xué)物熒光猝滅圖Fig.2 Double-logarithm curves of eight flavonoid phytochemicals quenching BSA fluorescence

4 討論

槲皮素、橙皮素和柚皮素均比它們相應(yīng)的苷蘆丁、異槲皮素、橙皮苷和柚皮苷與BSA的結(jié)合作用要強(qiáng)，這可能是因?yàn)樘J丁、異槲皮素、橙皮苷和柚皮苷的羥基被糖苷基取代之后分子體積增大，由于空間位阻作用不利于其插入到BSA疏水腔。藥物與BSA的結(jié)合受藥物分子疏水性的影響，因?yàn)樯彼岬仁杷园被釟埢蠖辔挥贐SA疏水腔內(nèi)，脂溶性的藥物更易進(jìn)入疏水腔從而與BSA形成分子締合物，槲皮素、橙皮素和柚皮素較蘆丁、異槲皮素、橙皮苷和柚皮苷的脂溶性好，更易進(jìn)入BSA的疏水腔，使 BSA 熒光猝滅［3，5，7，9］。

A環(huán)C7位上的糖苷基取代要比C環(huán)C3位糖苷基取代對(duì)黃酮類化合物與BSA的結(jié)合影響大。橙皮苷和柚皮苷均為A環(huán)C7位上的雙糖苷基取代，它們均比C環(huán)C3位雙糖苷基取代的蘆丁的表觀結(jié)合常數(shù)低約1個(gè)數(shù)量級(jí)。更進(jìn)一步推論A環(huán)可能是黃酮類化合物插入BSA疏水區(qū)的關(guān)鍵部位。淫羊藿苷比橙皮苷和柚皮苷結(jié)合作用強(qiáng)，可能由于淫羊藿苷A環(huán)C7位上的糖苷基取代僅為單糖，體積小于橙皮苷和柚皮苷，而A環(huán)C8位上的烯烴結(jié)構(gòu)又增加了淫羊藿苷的脂溶性，故其與BSA的結(jié)合作用強(qiáng)于橙皮苷和柚皮苷。

黃酮類化合物可通過(guò)氫鍵和(或)疏水作用與BSA相互作用［10-12］。這也說(shuō)明槲皮素、橙皮素和柚皮素與BSA的結(jié)合作用更強(qiáng)，是因?yàn)樗鼈兗扔懈嗔u基基團(tuán)參與的氫鍵作用，又有母核的疏水作用。而橙皮苷和柚皮苷由于空間位阻較大，插入BSA的疏水區(qū)困難，故主要通過(guò)氫鍵與BSA結(jié)合，結(jié)合的強(qiáng)度自然就弱于槲皮素、橙皮素和柚皮素。異槲皮素和蘆丁與BSA的結(jié)合強(qiáng)度居中，可能由于其糖苷基的位置離插入到蛋白質(zhì)疏水區(qū)的位置相對(duì)較遠(yuǎn)，雖因體積的增大對(duì)結(jié)合產(chǎn)生阻礙作用，但其影響遠(yuǎn)沒(méi)有橙皮苷和柚皮苷的大。

總之，糖苷基的取代對(duì)黃酮類化合物與BSA的結(jié)合作用有很大影響。A環(huán)C7位上的糖苷基取代可能是影響二者結(jié)合的關(guān)鍵基團(tuán)，A環(huán)可能是黃酮類化合物插入到BSA疏水區(qū)的關(guān)鍵部分。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為深入研究黃酮類化合物與蛋白的作用機(jī)理、探索藥物分子構(gòu)效關(guān)系提供有價(jià)值的信息，并對(duì)闡明黃酮類化合物在體內(nèi)的運(yùn)輸過(guò)程及對(duì)相應(yīng)疾病的預(yù)防和治療有提供一定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

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The binding and structural association of flavonoids with bovine serum albumin

CUI Yan-hua1，GUO Chun-mei2，SUN Ming-zhong2，GUO Yi-meng1，YU Hong-shan3，LIU Shu-qing1
(1.Department of Biochemistry and Molecular Biology，Dalian Medical University，Dalian 116044，China;2.Department of Biotechnology，Dalian Medical University，Dalian 116044，China;3.School of Bioengineering，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，China)

Purpose To investigate the binding capacities and structural association of eight flavonoids with similar core structure with bovine serum albumin(BSA).Methods As the flavonoids can quench the intrinsic fluorescence of tryptophan residues，the apparent association constant(KA)and the number of flavonoids binding to BSA were determined by fluorescence spectroscopy following the derived fluorescence quenching equation.Results The binding capacities of eight flavonoid phytochemicals were ordered as hesperetin(5.59×105)＞quercetin(4.94×105)＞naringenin(3.04×105) ＞isoquercitrin(4.66×104) ＞icariin(3.60×104) ＞rutin(1.65×104) ＞ hesperidin(2.50×103)＞naringin(8.70×102).Conclusion Glycoside substituent plays an important role in the interaction of flavonoids with BSA.The A ring of flavonoids should be the critical structural component merging into the hydrophobic region of BSA.The group at the site of C7was the key group interrupting the binding of flavonoid to BSA.The current work investigated the interaction and structural basis of flavonoids binding to BSA.The results provided certain experimental data for revealing the transport，metabolism and distribution of flavonoids in vivo.

flavonoids;bovine serum albumin;fluorescence;structure

Q284

A

1005-1678(2012)06-0728-04

2012-03-15

國(guó)家自然科學(xué)基金(81050010，81100722);遼寧省教育廳高等學(xué)?？蒲许?xiàng)目(2008S077);遼寧省自然科學(xué)基金(20082158)

崔艷花，女，研究生，從事植物化學(xué)物生物學(xué)意義研究;劉淑清，通信作者，博士，副教授，主要從事疾病蛋白組學(xué)和腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移研究，Tel:0411-86110307，E-mail:lsqsmz@163.com。