馬嬌穎，章成昌，仇黎鵬，姜玉濤，閆璐穎，陳 菁，陳建華

(中國藥科大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210009)

重組畢赤酵母胸腺肽α1-人血清白蛋白基因工程菌高密度發(fā)酵及分離純化

馬嬌穎，章成昌，仇黎鵬，姜玉濤，閆璐穎，陳 菁，陳建華

(中國藥科大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210009)

目的 研究重組畢赤酵母胸腺肽α1-人血清白蛋白(Tα1-HSA)基因工程菌在30 L發(fā)酵罐中高密度發(fā)酵表達(dá)Tα1-HSA融合蛋白的發(fā)酵工藝及產(chǎn)物的分離純化方法。方法 采用兩步發(fā)酵法進(jìn)行重組畢赤酵母Tα1-HSA基因工程菌的高密度發(fā)酵。發(fā)酵液經(jīng)超濾濃縮，陰離子交換色譜，親和色譜，凝膠過濾色譜等步驟進(jìn)行分離純化。結(jié)果 發(fā)酵結(jié)束后，菌體細(xì)胞濕重達(dá)到350 g/L，發(fā)酵液中蛋白產(chǎn)量達(dá)到2.0 g/L。發(fā)酵液經(jīng)分離純化后獲得了純度較高的重組Tα1-HSA融合蛋白，HPLC分析純度達(dá)97.5%。結(jié)論 重組畢赤酵母Tα1-HSA基因工程菌高密度發(fā)酵的成功及分離純化方法的建立為Tα1-HSA的進(jìn)一步研究和開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

胸腺肽α1;人血清白蛋白;畢赤酵母;高密度發(fā)酵;分離純化

胸腺肽是胸腺分泌的具有生物活性的多種多肽類物質(zhì)的統(tǒng)稱，亦稱胸腺素。胸腺肽α1(Tα1)是最早從胸腺素組分5(TF5)中分離出來的一種小分子活性多肽，由28個氨基酸殘基組成，分子質(zhì)量為3 108.37，是TF5的主要活性成分，具有很高的免疫增強活性。

Tα1主要用于治療癌癥、乙型肝炎、丙型肝炎以及HIV的感染［1］，另外Tα1在治療嚴(yán)重敗血癥疾?。?-3］、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)［4］、嚴(yán)重急性呼吸器官綜合癥(SARS)［5］及全身感染性疾病等均有顯著效果。目前，市場的 Tα1主要為化學(xué)合成［6］，但化學(xué)合成的 Tα1成本較高，采用基因工程方法表達(dá)胸腺肽是一種簡潔有效的途徑，但是多肽表達(dá)后往往純化困難，難以實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。

人血清白蛋白(HSA)是血漿的重要成分，利用HSA在體內(nèi)較長的半衰期，將Tα1與HSA融合表達(dá)，無需酶切即可得到具有生物活性的大分子重組蛋白，純化方便，而且胸腺肽的半衰期得到延長。

巴斯德畢赤酵母是一種能高效表達(dá)外源蛋白的表達(dá)系統(tǒng)，具有遺傳穩(wěn)定性好、表達(dá)水平高、蛋白可翻譯后加工、產(chǎn)物可分泌、可高密度發(fā)酵等許多優(yōu)點，本研究中的Tα1-HSA融合蛋白可利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行分泌表達(dá)。相信利用基因工程技術(shù)進(jìn)行Tα1-HSA融合蛋白的研究與生產(chǎn)將具有非常重要的意義。

1 材料

重組畢赤酵母Tα1-HSA基因工程菌，本實驗室構(gòu)建保存。

酵母提取物、酪蛋白胨，英國Oxiod公司;Bradford蛋白含量測定試劑盒，南京建成生物工程研究所。

YPD培養(yǎng)基:1%酵母提取物，2%胰蛋白胨，2%葡萄糖;發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基:85%H3PO426.7 mL/L，CaSO4·2H2O 0.93 g/L，K2SO418.2 g/L，MgSO4·7H2O 14.9 g/L，KOH 4.13 g/L，甘油 40.0 g/L，組氨酸 0.15g/L，微量元素(PTM1)4.0 mL/L。

PTM1:CuSO4·5H2O 6.0 g/L，KI 0.088 g/L，MnSO43.0 g/L，Na2MoO4·2H2O 0.2 g/L，H3BO30.02 g/L，ZnCl220.0 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 65.0 g/L，CoCl20.5 g/L，Biotin 0.2 g/L，H2SO45 mL/L。

30 L發(fā)酵罐，德國Biostar公司;超濾儀器，Millipore公司;蛋白電泳儀、凝膠成像儀，Bio-rad公司;Agilent 1100高效液相色譜儀，美國Agilent公司。

2 方法

2.1 重組畢赤酵母Tα1-HSA基因工程菌高密度發(fā)酵

2.1.1 種子培養(yǎng) 從新鮮YPD平板挑取重組畢赤酵母Tα1-HSA基因工程菌單菌落接種于YPD液體培養(yǎng)基100 mL中，于30℃ 恒溫、220 r/min搖床培養(yǎng)18～20 h，轉(zhuǎn)接于YPD液體培養(yǎng)基1.2 L中，于30℃ 恒溫、220 r/min搖床培養(yǎng)18～20 h。

2.1.2 高密度發(fā)酵 配制發(fā)酵培養(yǎng)基12 L，加入30 L發(fā)酵罐，121℃、30 min高壓滅菌培養(yǎng)基、發(fā)酵罐及管道。待發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)基冷卻到室溫時，加入PTM1 24 mL，并接入種子培養(yǎng)液1.2 L，設(shè)置初始參數(shù)，啟動發(fā)酵程序。待培養(yǎng)基中甘油耗盡，向培養(yǎng)基中流加甘油溶液，至菌體濕重達(dá)到350 g/L左右停止補加甘油，開始流加甲醇誘導(dǎo)。發(fā)酵過程始終控制溫度在30℃，發(fā)酵液pH值為5.0，以調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量的方式控制發(fā)酵液的溶氧為30%左右。誘導(dǎo)表達(dá)96 h后，結(jié)束發(fā)酵，發(fā)酵液4℃、8 000 r/min離心20 min，上清用于分離純化。

2.2 重組Tα1-HSA融合蛋白分離純化

2.2.1 超濾濃縮 參考蔡立濤等［7］的方法，使用孔徑截留相對分子質(zhì)量為30 kD的超濾膜進(jìn)行超濾，至終體積為原發(fā)酵液體積的1/10。

2.2.2 DEAE Cellulose-52 陰離子交換色譜 柱體積30 mL，使用平衡緩沖液A(10 mmol/L磷酸緩沖液，pH 7.0)平衡色譜柱，上樣后用平衡緩沖液A沖洗至基線平衡，再用平衡緩沖液A和洗脫液B(10 mmol/L 磷酸緩沖液，pH 7.0，1.5 mol/L NaCl)進(jìn)行0～1.5 mol/L NaCl梯度洗脫，收集融合蛋白峰。

2.2.3 Sephadex G-25凝膠過濾色譜 柱體積150 mL，使用平衡緩沖液C(50 mmol/L磷酸緩沖液，pH 7.0)平衡色譜柱，上樣后用平衡緩沖液沖洗，收集融合蛋白峰。

2.2.4 Blue Sepharose 6 Fast Flow親和色譜 柱體積30 mL，使用平衡緩沖液C平衡色譜柱，上樣后用平衡緩沖液沖洗至基線平衡，然后用洗脫緩沖液(50 mmol/L 磷酸緩沖液，pH 7.0，1.5 mol/L NaCl)洗脫融合蛋白。

2.2.5 Sephadex G-200凝膠過濾色譜 柱體積150 mL，用水平衡色譜柱，上樣后用水沖洗，收集融合蛋白峰，將所得融合蛋白冷凍干燥，－20℃ 保存。

2.3 重組Tα1-HSA融合蛋白純度分析

2.3.1 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)Tα1-HSA融合蛋白的電泳純度測定采用SDSPAGE進(jìn)行檢測。分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為5%，上樣量20μL，考馬斯亮藍(lán)R250染色，對電泳結(jié)果用凝膠成像儀成像，應(yīng)用分析軟件分析各條帶的百分比，計算目的蛋白所占百分比。

2.3.2 高效液相色譜法(HPLC) 采用HPLC對Tα1-HSA融合蛋白進(jìn)行純度檢測。色譜柱:Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)。流動相A:10%乙腈溶液(含0.1%三氟乙酸);流動相B:90%乙腈溶液(含0.1%三氟乙酸)，梯度洗脫:0～25 min，20% ～80% 流動相 B。流速:1.0 mL/min，柱溫:25℃，檢測波長:280 nm。以重組 Tα1-HSA融合蛋白色譜峰計算理論板數(shù)應(yīng)不低于1 000。按面積歸一化法計算重組 Tα1-HSA融合蛋白的純度。

3 結(jié)果

3.1 重組畢赤酵母Tα1-HSA基因工程菌高密度發(fā)酵

發(fā)酵結(jié)束時，收獲發(fā)酵上清液20 L，菌體濕重為350 g/L。誘導(dǎo)6 h時，發(fā)酵上清中就有重組Tα1-HSA融合蛋白表達(dá)，隨著誘導(dǎo)時間的增加蛋白表達(dá)量也不斷增加，細(xì)胞濕重曲線及融合蛋白表達(dá)曲線見圖1。Bradford法測定蛋白濃度顯示，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)96 h后，發(fā)酵液中蛋白的含量為2.0 g/L，成功實現(xiàn)了30 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵生產(chǎn)重組Tα1-HSA融合蛋白。表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE結(jié)果如圖2。

3.2 重組Tα1-HSA融合蛋白分離純化

發(fā)酵上清液經(jīng)超濾處理后，可去除無機鹽分子及一些小分子代謝產(chǎn)物，總蛋白濃度為發(fā)酵上清的8.6倍，目的蛋白回收率為91.8%。經(jīng)DEAE Cellulose-52陰離子交換色譜，Sephadex G-25凝膠過濾色譜，Blue Sepharose6 Fast Flow親和色譜，Sephadex G-200凝膠過濾色譜，經(jīng)過整個純化過程，重組Tα1-HSA融合蛋白的純度由初始的70.0%提高到了97.5%，目的蛋白收率為40%，見表1。

圖1 細(xì)胞濕重曲線及融合蛋白表達(dá)曲線Fig.1 Curves for cell wet weight and protein expression in recombinant P.pastoris cultivation

圖2 不同誘導(dǎo)時間下融合蛋白表達(dá)情況的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis for expression of protein in different time

表1 Tα1-HSA純化結(jié)果Tab.1 Result of purified Tα1-HSA

3.2.1 DEAE Cellulose-52陰離子交換色譜 超濾后濃縮液經(jīng)DEAE Cellulose-52陰離子交換色譜，得到三個組分P1、P2、P3(如圖3)，電泳鑒定P1為少量雜蛋白，P2為色素和大部分雜蛋白，P3為目的蛋白，合并P3峰。

3.2.2 Blue Sepharose 6 Fast Flow親和色譜 將上一步合并的目的蛋白溶液經(jīng)Sephadex G-25凝膠過濾色譜脫鹽，再經(jīng)Blue Sepharose 6 Fast Flow親和色譜，得到兩個組分P1和P2(如圖4)，電泳鑒定P1為雜蛋白，P2為目的蛋白，合并P2峰。

圖3 DEAE-52色譜純化Tα1-HSAFig.3 DEAE-52 chromatography of Tα1-HAS

圖4 Blue Sepharose 6 FF色譜純化Tα1-HSAFig.4 Blue Sepharose 6 FF chromatography of Tα1-HSA

3.2.3 Sephadex G-200凝膠過濾色譜 將上一步合并的目的蛋白融合經(jīng)Sephadex G-200凝膠過濾色譜，得到兩個組分P1和P2(如圖5)，電泳鑒定P1為雜蛋白，P2為目的蛋白，合并P2峰。

圖5 Sephadex G-200色譜純化Tα1-HSAFig.5 Sephadex G-200 chromatography of Tα1-HSA

3.3 純化過程中重組Tα1-HSA融合蛋白純度鑒定

SDS-PAGE檢測，純化后的重組Tα1-HSA融合蛋白為單一條帶(如圖6)。融合蛋白純度經(jīng)HPLC分析為純度為97.5%(如圖7)。結(jié)果表明發(fā)酵液中的重組Tα1-HSA融合蛋白經(jīng)過以上分離純化過程，取得了較好的純化效果。

4 討論

Tα1作為一種免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)，具有很高的臨床應(yīng)用價值，但是作為一種小分子活性多肽，其在體內(nèi)易被代謝和清除，半衰期較短［8］。謝琦等［9］將Tα1于胸腺5肽融合，使Tα1和胸腺5肽發(fā)揮協(xié)同作用，但Tα1的半衰期并未提高。本研究將Tα1與HSA融合表達(dá)，不僅Tα1的自身活性不受影響，而且其半衰期得到延長，易于純化。高密度發(fā)酵是基因工程菌提高外源蛋白表達(dá)水平的一種重要策略，畢赤酵母高密度發(fā)酵表達(dá)外源蛋白是工業(yè)化生產(chǎn)重組蛋白的重要途徑，目前已有多種重組蛋白通過畢赤酵母高密度發(fā)酵高效表達(dá)。酵母工程菌株的發(fā)酵主要分為3個階段:第一階段，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長;第二階段，流加甘油階段，此階段菌體迅速積累;第三階段，使用甲醇作為碳源進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，此時融合蛋白開始大量表達(dá)，耗氧量迅速增加。

圖6 純化過程中Tα1-HSA的SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of Tα1-HSA after each step of purification

圖7 HPLC分析Tα1-HSAFig.7 HPLC analysis of Tα1-HSA

本研究實現(xiàn)了重組Tα1-HSA融合蛋白在畢赤酵母中高效表達(dá)。在30 L多參數(shù)全自動發(fā)酵罐中，菌體細(xì)胞濕重達(dá)到350 g/L，誘導(dǎo)96 h后蛋白產(chǎn)量達(dá)到2.0 g/L，并且通過SDS-PAGE驗證目的蛋白并無明顯降解，蛋白酶的表達(dá)及活性得到抑制，目的蛋白高效表達(dá)。

對于生物大分子的分離，只使用單一的色譜方法很難將待分離物質(zhì)完全分離，通常將幾種原理不同的色譜技術(shù)組合起來以獲得理想的純化效果［10］。本文建立了重組Tα1-HSA融合蛋白純化方法，總回收率為40%。其中超濾濃縮去除了部分小分子雜質(zhì)及色素，成本低，可處理大量樣品。DEAE Cellulose-52陰離子交換色譜可有效的去除大量色素及雜蛋白，具有載量大、分辨率好、流速高等優(yōu)點。Blue Sepharose 6 Fast Flow親和色譜可特異性結(jié)合目的蛋白，使目的蛋白純度得到進(jìn)一步提高，且穩(wěn)定性好，基團脫落少，使用方便，可用于規(guī)?；a(chǎn)應(yīng)用。Sephadex G-200凝膠過濾色譜用于精制目的蛋白。經(jīng)超濾、DEAE Cellulose-52陰離子交換色譜，Sephadex G-25凝膠過濾色譜，Blue Sepharose 6 Fast Flow親和色譜，Sephadex G-200凝膠過濾色譜等步驟，重組Tα1-HSA融合蛋白純度達(dá)97.5%。在重組Tα1-HSA融合蛋白的分離純化過程中，本研究根據(jù)實際需要將不同純化方法整合，不但使目的蛋白損失降低，而且純度得到提高，本工藝路線步驟少、目的蛋白回收率高、操作方便、工藝穩(wěn)定、易于放大、易于自動控制，具有工業(yè)化潛力。

本研究中的新型胸腺肽實現(xiàn)了Tα1的高效表達(dá)，并且建立了純化路線，然而要將其開發(fā)成為新一代的長效藥物，還需對其生物學(xué)活性和藥代動力學(xué)特征進(jìn)行進(jìn)一步的考察和確定。

［1］Juan Lia，Chun Huiliua，Wang Fengshan.Thymosin alpha 1:Biological activities，applications and genetic engineering production［J］.Peptides，2010，31(11):2151-2158.

［2］俞 楊，田金徽，楊克虎，等.胸腺肽α1治療膿毒癥的系統(tǒng)評價［J］.中國危重病急救醫(yī)學(xué)，2009，21(1):21-24.

［3］Yumin L，Hao C，Xun L，et al.A new immunomodulatory therapy for severe sepsis:ulinastatin plus thymosin(alpha)1 ［J］.JIntensive Care Med，2009，24(1):47-53.

［4］Ji SM，Li L S，Sun QQ，et al.Immunoregulation of thymosin alpha 1 treatment of cytomegalovirus infection accompanied with acute respiratory distress syndrome after renal transplantation ［J］.Transplant Proc，2007，39(1):115-119.

［5］高占成，朱繼宏，孫 焱，等.醫(yī)院內(nèi)SARS暴發(fā)流行的臨床分析［J］.中國危重病急救醫(yī)學(xué)，2003，15(6):332-335.

［6］李 潔，王曉杰，鄒素蘭.胸腺肽的臨床應(yīng)用與研究進(jìn)展［J］.中國藥房，2008，19(14):1108-1109.

［7］蔡立濤，徐 祥，王婷婷，等.納豆激酶基因在畢赤酵母中的表達(dá)純化及抗體制備［J］.中國生化藥物雜志，2010，31(1):10-13.

［8］Qingfeng Liu，He Zhang，Guichen Zhou，et al.In vitro and in vivo study of thymosin alphal biodegradable in situ forming poly(lactide-co-glycolide)implants［J］.Int J Pharm，2010，397(1-2):122-129.

［9］謝 琦，李 娟，王鳳山.胸腺素α1-胸腺五肽在大腸桿菌中的表達(dá)及表達(dá)條件優(yōu)化［J］.中國生化藥物雜志，2011，32(4):265-268.

［10］劉 睿，李友賓，段金廒.現(xiàn)代生物技術(shù)在動物藥研究中的應(yīng)用［J］.中國生化藥物雜志，2008，29(4):287-290.

High cell density fermentation and purification of recombinant Pichia Pastoris Tα1-HSA genetically engineered bacteria

MA Jiao-ying，ZHANG Cheng-chang，QIU Li-peng，JIANG Yu-tao，YAN Lu-ying，CHEN Jing，CHEN Jian-hua
(School of Life Science and Technology，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China)

Purpose To study the high cell density fermentation of recombinant Pichia Pastoris Tα1-HSA genetically engineered bacteria，and the purification of expressed target protein.Methods A two-step fermentation is taken for the high cell density fermentation of recombinant Pichia Pastoris Ta1-HSA genetically engineered bacteria.Tα1-HSA was purified from fermentation broth by ultrafiltration，anion excha-nge chromatography，affinity chromatography and gel filtration chromatography.Results Through the control and optimization of fermentation conditions，the bacterial cell wet weight could reach 350 g/L and the productivity of expressed Tα1-HSA could reach 2.0 g/L in 30 L fermentor.High purity recombinant Ta1-of HSA fusion protein is obtained after separation and purification.The HPLC analysis shows that the purified Tα1-HSA has an overall purity of 97.5%.Conclusion The success of the high cell density fermentation and purification has laid a foundation for the further research and development of Tα1-HSA.

Tα1;HSA;Pichiα pastoris;high cell density fermentation;purification

TQ929;Q78

A

1005-1678(2012)06-0720-05

2012-03-22

馬嬌穎，女，碩士研究生，E-mail:majiaoying@163.com;陳建華，男，通信作者，教授，碩士生導(dǎo)師，Tel:025-83271265，E-mail:jhchen@cpu.ed.cn。