張紀(jì)亮，朱文文，孫 平，熊建利，郭黛健

（1.河南科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河南 洛陽(yáng)471003；2.洛陽(yáng)師范學(xué)院，河南 洛陽(yáng)471022）

三丁基錫對(duì)褐菖鮋精巢性激素受體表達(dá)的影響＊

張紀(jì)亮1，朱文文1，孫 平1，熊建利1，郭黛健2

（1.河南科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河南 洛陽(yáng)471003；2.洛陽(yáng)師范學(xué)院，河南 洛陽(yáng)471022）

三丁基錫（Tributyltin，TBT）能夠影響魚類生殖功能，而有關(guān)TBT對(duì)魚類生殖細(xì)胞發(fā)育至關(guān)重要的雄激素和雌激素受體的影響還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以海洋經(jīng)濟(jì)魚類褐菖鲉（Sebastiscusmarmoratus）為對(duì)象，研究環(huán)境水平TBT（1，10和100ng/L）對(duì)精巢雄激素和雌激素受體表達(dá)的影響。結(jié)果表明，TBT暴露能夠抑制褐菖鲉精巢發(fā)育和精巢雌激素受體蛋白的水平，并且發(fā)現(xiàn)雌激素受體主要定位于精巢精小葉腔間隙。小葉腔間隙的雌激素受體蛋白水平降低可能影響支持細(xì)胞和間隙細(xì)胞的正常功能，從而影響精巢的正常發(fā)育。TBT暴露對(duì)雄激素受體的表達(dá)并沒有顯著的影響。該結(jié)果為全面了解TBT產(chǎn)生魚類生殖毒性效應(yīng)、途徑和機(jī)制提供了新的重要的資料。

三丁基錫；褐菖鮋；精巢；雌激素受體

（王佳實(shí) 編輯）

有機(jī)錫化合物，特別是三丁基錫（Tributyltin，TBT），被廣泛用于海洋船只防污涂料。Jiang等［1］對(duì)大連、天津、青島、北海、秦皇島和煙臺(tái)等港口采樣測(cè)定，發(fā)現(xiàn)樣點(diǎn)無(wú)一例外地存在TBT污染，污染程度從0.5 ng/L（低于檢測(cè)極限）到幾百ng/L。研究表明，有機(jī)錫能夠影響動(dòng)物生殖功能，干擾體內(nèi)激素的分泌，造成生殖和遺傳方面的不良后果［2］。激素核受體在生殖和發(fā)育中可能起重要作用，核受體與配體結(jié)合活化，進(jìn)入核內(nèi)與靶基因中的激素反應(yīng)元件結(jié)合，激活或抑制靶基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育和生殖。與生殖細(xì)胞的發(fā)育有關(guān)的受體主要包括雌激素受體（Estrogen receptor，ER）和雄激素受體（Androgen receptor，AR）。而三丁基錫對(duì)魚類這兩種核受體的影響還未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以海洋經(jīng)濟(jì)魚類褐菖鲉（Sebastiscusmarmoratus）為對(duì)象，研究環(huán)境水平TBT（1，10和100 ng/L）對(duì)精巢性激素受體表達(dá)的影響。褐菖鲉是一種卵胎生、體內(nèi)受精的硬骨魚，容易采集，在實(shí)驗(yàn)室容易飼養(yǎng)，適合作為生態(tài)毒理學(xué)的研究對(duì)象。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

褐菖鲉采于福建廈門海域，體重25～50g。雄性有乳白色突起狀的生殖器，根據(jù)此特征選擇雄性實(shí)驗(yàn)魚。實(shí)驗(yàn)魚先在清潔沙濾海水中暫養(yǎng)7d，用充氣機(jī)連續(xù)充氣。

1.2 污染實(shí)驗(yàn)

TBT（純度≥97%，F(xiàn)luka公司，美國(guó)）先用無(wú)水乙醇配制成一定質(zhì)量濃度的儲(chǔ)備液，避光于4℃保存，實(shí)驗(yàn)前用砂濾海水分別配制成1，10和100ng/L三種質(zhì)量濃度。對(duì)照組的每升海水中加入1μL無(wú)水乙醇。每組30只褐菖鮋分別于60L不同質(zhì)量濃度的TBT的水體中飼養(yǎng)。每日更換一半相同污染質(zhì)量濃度的海水。取樣前3d停止喂食。實(shí)驗(yàn)期間水溫14±2℃，S為22～24。暴露50d后取樣。精巢放入中性甲醛固定液中固定，用于組織學(xué)觀察。

1.3 組織化學(xué)

按照免疫組化試劑盒說明書（華美生物，中國(guó)洛陽(yáng)）操作：切片脫蠟至水，3%雙氧水甲醇溶液中浸洗10 min去除內(nèi)源性過氧化物酶，接著在檸檬酸鹽緩沖液中微波抗原修復(fù)10min，正常小牛血清37℃封閉30 min；滴加1：100稀釋的兔抗人ER或兔抗鼠AR受體抗體（一抗，NeoMarkers，美國(guó)），置4℃過夜，磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffer saline，PBS）洗3次；滴加生物素化羊抗兔IgG抗體（二抗），置37℃30min，PBS洗3次；滴加SABC－Cy3，置37℃30min，PBS洗4次，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。陰性對(duì)照用正常兔血清IgG代替一抗，其余步驟相同。組織切片在Olympus BX41型顯微鏡下觀察拍照。

在6個(gè)不同的視野隨機(jī)選擇10個(gè)圓形或半圓形的精小葉，利用OLYSIA BioReport軟件分別計(jì)算其周長(zhǎng)（c）。精小葉直徑（d）根據(jù)公式：d＝c/π進(jìn)行換算。采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±S.E.）表示。單因素方差分析的方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間數(shù)據(jù)用Duncan法進(jìn)行顯著性水平的分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 TBT對(duì)精巢發(fā)育的影響

褐菖鲉精巢由許多精小葉構(gòu)成。在成熟的精巢中精子充滿整個(gè)精小葉腔。除生殖細(xì)胞外，精巢精小葉間還存在另外2種非常重要的細(xì)胞：支持細(xì)胞和間隙細(xì)胞。由于這兩種細(xì)胞較小，在光學(xué)顯微鏡下很難辨別。

圖1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)TBT暴露50d后褐菖鲉精巢內(nèi)ER蛋白表達(dá)注：棕色塊狀為間隙細(xì)胞ER蛋白；深紫色塊狀體為精子Fig.1 Immunohistochemical detection of ER in the testes of Sebastiscusmarmoratus exposed to TBT for 50d

圖2 TBT暴露50d后褐菖鲉精巢精小葉直徑注：上標(biāo)字母不同的組間具有顯著性差異Fig.2 Lobules diameter in Sebastiscusmarmoratus exposed to TBT for 50days

TBT暴露50d后雄性褐菖鲉精巢發(fā)育受到抑制（圖1）。在對(duì)照組褐菖鲉精巢內(nèi)精小葉腔內(nèi)充滿了成熟精子（圖1a）。1ng/L TBT暴露組褐菖鲉精巢發(fā)育與對(duì)照組相比未表現(xiàn)出明顯差異。10ng/L TBT暴露組褐菖鲉精巢精小葉腔內(nèi)也存在成熟精子，但精子數(shù)量和密度明顯低于對(duì)照組和1ng/L TBT暴露組（圖1c）。在100ng/L TBT暴露組中成熟精子僅僅存在于少數(shù)精小葉腔中，個(gè)別精巢中甚至不存在成熟精子（圖1d）。另外，與對(duì)照組相比，TBT暴露50d后各暴露組的精小葉直徑均有降低，表現(xiàn)出劑量依賴型抑制下降，其中100ng/L暴露組顯著性下降（圖2）。

2.2 TBT對(duì)精巢ER表達(dá)的影響

運(yùn)用免疫組織化學(xué)的方法在精巢內(nèi)定位ER蛋白，發(fā)現(xiàn)ER蛋白主要分布在小葉間隙間（圖1）。另外，與對(duì)照組相比，各暴露組精巢內(nèi)ER蛋白均被抑制，而且隨著暴露質(zhì)量濃度的升高，對(duì)ER蛋白的抑制程度不斷增加，表現(xiàn)出良好的劑量－效應(yīng)。

2.3 TBT對(duì)精巢AR表達(dá)的影響

運(yùn)用免疫組織化學(xué)的方法在精巢內(nèi)定位AR蛋白，發(fā)現(xiàn)AR蛋白主要分布在精細(xì)胞上（圖3）。另外在精母細(xì)胞上分布有極少量的AR蛋白（圖3）。在小葉間隙、精原細(xì)胞以及成熟的精子上都沒有發(fā)現(xiàn)AR蛋白。與對(duì)照組相比，各暴露組精巢內(nèi)AR蛋白并沒有顯著的變化。

圖3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)TBT暴露50d后褐菖鲉精巢內(nèi)AR蛋白變化注：白色塊狀體為精細(xì)胞；紫色塊狀體為精母細(xì)胞AR蛋白；深紫色塊狀體為精子Fig.3 Immunohistochemical detection of AR in the testes of Sebastiscusmarmoratus exposed to TBT for 50d

3 討 論

在本實(shí)驗(yàn)中，TBT暴露抑制了精巢的發(fā)育。和對(duì)照組相比，10，100ng/L TBT暴露組的精小葉直徑顯著性降低。Gimeno等曾報(bào)道，精小葉直徑和精子發(fā)生有關(guān)［3］，精小葉直徑降低則意味著精子發(fā)生受到抑制。在本實(shí)驗(yàn)中10，100ng/L TBT暴露組精巢內(nèi)成熟精子數(shù)量降低。Haubruge等曾經(jīng)報(bào)道，將虹鳉（Poeciliareticulata）暴露于11.2ng/L TBT 21d后精子數(shù)量下降40%～75%［4］。這和本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果是一致的。另外，研究表明類雌激素污染物［5－7］和抗雄激素污染物［7－9］通過模仿或抑制內(nèi)源性雌激素或雄激素與ER或AR結(jié)合來(lái)抑制精巢發(fā)育。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TBT同樣能夠干擾性激素受體，抑制精巢發(fā)育。

研究證明，雌激素的許多作用都是通過ER介導(dǎo)的［10］。目前，關(guān)于ER在硬骨魚類性腺定位的研究還很少。Miura等運(yùn)用原位雜交的方法在日本鰻鱺（Anguilljaponica）精巢內(nèi)對(duì)ER進(jìn)行定位，發(fā)現(xiàn)ER主要定位在精原細(xì)胞周圍的支持細(xì)胞和間隙細(xì)胞［11］，這和本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果基本一致。另外，Andreassen等［12］運(yùn)用免疫組織化學(xué)的方法研究發(fā)現(xiàn)ER主要定位于對(duì)錦（Zoarcesviviparus）精巢的支持細(xì)胞和初級(jí)精原細(xì)胞。盡管和我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致，但這可能是由于選取的實(shí)驗(yàn)魚類處于不同發(fā)育時(shí)期所致，因?yàn)樵诒緦?shí)驗(yàn)中，褐菖鲉精巢中并不存在初級(jí)精原細(xì)胞。在本實(shí)驗(yàn)中，精巢生殖細(xì)胞上都沒有存在ER蛋白，因此雌激素可能通過激活小葉腔間隙間細(xì)胞上的ER間接影響精巢內(nèi)生殖細(xì)胞的發(fā)育。ER對(duì)精巢的發(fā)育十分重要。Hess等［13］指出缺失雌激素受體的轉(zhuǎn)基因雄性小鼠不育，精子發(fā)生紊亂，睪丸精子容量和精子活力降低，精巢輸出管中流體產(chǎn)物增加。在本實(shí)驗(yàn)中，TBT暴露組褐菖鲉精巢的ER蛋白水平降低，這可能是精巢發(fā)育受到抑制的原因之一。Andreassen等［12］報(bào)道，在對(duì)錦精巢內(nèi)，特別是支持細(xì)胞上，17β－雌二醇能夠自動(dòng)調(diào)節(jié)ER的表達(dá)。因此，本實(shí)驗(yàn)中ER表達(dá)水平的降低可能和17β－雌二醇水平的降低有關(guān)。以前的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)TBT能夠抑制褐菖鮋精巢17β－雌二醇水平［14］。

TBT抑制了褐菖鲉精巢小葉腔間隙的ER表達(dá)水平。在小葉腔間隙分布著支持細(xì)胞和間隙細(xì)胞。這兩種細(xì)胞，特別是支持細(xì)胞，對(duì)精巢的正常發(fā)育十分重要［15］。Rasmussen等［16］曾報(bào)道，對(duì)錦精子發(fā)生的紊亂的一個(gè)非常重要的原因是支持細(xì)胞的衰退。因此，小葉腔間隙的ER表達(dá)水平降低可能影響支持細(xì)胞和間隙細(xì)胞的正常功能，從而影響精巢的正常發(fā)育。在本實(shí)驗(yàn)中AR蛋白主要定位在精巢內(nèi)精細(xì)胞上，并且TBT暴露對(duì)AR蛋白表達(dá)沒有顯著影響。因此，在TBT抑制精巢發(fā)育的過程中，AR作用并不明顯。

本研究結(jié)果表明，TBT對(duì)ER表達(dá)水平的抑制是魚類精巢發(fā)育抑制的一個(gè)重要原因。該結(jié)果豐富了三丁基錫內(nèi)分泌干擾機(jī)制。盡管ER可能介導(dǎo)了TBT對(duì)褐菖鲉精巢發(fā)育的影響過程，但詳細(xì)的機(jī)制還不是很清楚，因此還需要更加深入的研究。

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Effect of Tributyltin on the Sex Hormone Receptor in Testis of Sebastiscus Marmoratus

ZHANG Ji－liang1，ZHU Wen－wen1，SUN Ping1，XIONG Jian－li1，GUO Dai－jian2
（1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，HenanUniversityofScienceandTechnology，Luoyang 471003，China；2.LuoyangNormalUniversity，Luoyang 471022，China）

Tributyltin（TBT）can affect the reproductive function in fishes.However，few study reports the effects of TBT on estrogen receptor or androgen receptor which is related to the development of germ cells.Therefore，the present study was conducted to investigate the effects of TPT at environmentally relevant concentrations（1，10and 100ng/L）on testicular estrogen receptor or androgen receptor in male rockfish Sebastiscus marmoratus.The results showed that TBT inhibited the testicular development and reduced the levels of estrogen receptor which was located in the interlobular septa.TBT interfered with estrogen receptor might be one of the reasons causing the dysfunction of Sertoli cells，which play a critical role during spermatogenesis.Androgen receptor levels were not shown significant changes after TBT exposure.The results provided new information which is important for fully understanding the reproductive toxic effects，pathway and mechanism of TBT.

Tributyltin；Sebastiscusmarmoratus；testis；estrogen receptor

April 8，2011

Q958

A

1671－6647（2012）02－0252－05

2011－04－08

國(guó)家自然科學(xué)基金——有機(jī)錫污染對(duì)海洋魚類性腺分化和發(fā)育的影響及其機(jī)制（20777061）；河南省教育廳科技重點(diǎn)研究項(xiàng)目——有機(jī)錫水體污染對(duì)魚類性腺發(fā)育的影響及其機(jī)制（12B240001）

張紀(jì)亮（1980－），男，河南新鄉(xiāng)人，副教授，博士，主要從事海洋生態(tài)毒理方面研究.E－mail：jiliang＿zhang＠126.com