趙琛 施茵 崔云華 王曉梅 馬曉芃 吳蓓玲 吳璐一 劉慧榮

溫和灸腎俞穴、關(guān)元穴對(duì)腎陽虛老年人衰老癥狀及外周血Rb蛋白表達(dá)的影響

趙琛 施茵 崔云華 王曉梅 馬曉芃 吳蓓玲 吳璐一 劉慧榮

目的 觀察溫和灸對(duì)腎陽虛老年人外周血成視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma，Rb)蛋白表達(dá)以及衰老癥狀的影響，探討溫和灸的抗衰老作用。方法 將60～75歲腎陽虛老年人81例隨機(jī)分為溫和灸治療組41例和衰老對(duì)照組40例。溫和灸治療組采用溫和灸腎俞穴、關(guān)元穴，18次為一個(gè)療程，連續(xù)治療兩個(gè)療程。采用積分表法觀察溫和灸對(duì)老年人治療后綜合情況的影響和癥狀改善情況，并用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血Rb蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 (1)經(jīng)溫和灸治療，腎陽虛老年人衰老癥狀積分較衰老對(duì)照組療效顯著降低(P＜0.01);(2)溫和灸第二療程末療效較第一療程末顯著提高(P＜0.01);(3)溫和灸治療組老年人外周血單個(gè)核細(xì)胞Rb蛋白陽性表達(dá)率顯著低于衰老對(duì)照組(P＜0.01)。結(jié)論 溫和灸可能通過干預(yù)腎陽虛老年人外周血Rb表達(dá)，改善衰老癥狀，降低衰老見證積分。

溫和灸;衰老;成視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白;臨床研究

Effect of suspended moxibustion on the pRb expression of peripheral blood in the kidney-yang deficiency aged people ZHAO Chen，SHI Yin，CUI Yun-hua，et al.Acupuncture Department，Yueyang Hospital of Integrative Chinese＆ Western Medicine Affiliated to Shanghai University of TCM，Shanghai 200437，China

衰老是指機(jī)體隨著年齡的增長(zhǎng)而出現(xiàn)各器官功能普遍的、逐漸降低的過程。溫和灸延緩衰老具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，歷來被認(rèn)為是養(yǎng)生保健、抗衰老的重要方法。有關(guān)溫和灸延緩衰老機(jī)理的研究多為整體、組織、器官水平的，證實(shí)其對(duì)老年人的內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、自由基代謝等都有良好的調(diào)節(jié)作用［1，2］。本課題組以往的研究證實(shí)，溫和灸腎俞穴和關(guān)元穴具有抗衰老的作用［3，4］，本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)老年人外周血成視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma，Rb)蛋白表達(dá)及溫和灸對(duì)其的影響，以期為溫和灸在實(shí)踐中預(yù)防衰老和延緩衰老提供新的科學(xué)理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

所有觀察對(duì)象均為2007年1月至2008年7月沙溪苑社區(qū)及上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所門診部年齡60～75歲志愿老年人(無嚴(yán)重疾病者，生活自理者)，共81例。按隨機(jī)數(shù)字表法分成溫和灸治療組和衰老對(duì)照組。溫和灸治療組41例，其中男15例，女26例;年齡最高75歲，最低60歲，平均(68.07±5.04)歲。衰老對(duì)照組40例，其中男17例，女23例;年齡最高75 歲，最低60 歲，平均(67.75 ±4.85)歲。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組老年人的人口學(xué)特征無顯著性差異(均P＞0.05)，具有可比性。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

診斷標(biāo)準(zhǔn)參照國(guó)家衛(wèi)生部頒布的《抗衰老藥物臨床研究指導(dǎo)原則》實(shí)行標(biāo)準(zhǔn)［5］，及第三次全國(guó)中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合老年醫(yī)學(xué)研究協(xié)作組會(huì)議制訂的《延緩衰老中藥的篩選規(guī)程和臨床觀察規(guī)范》的衰老辨證標(biāo)準(zhǔn)中腎陽虛證［6］。

表1 衰老辨證標(biāo)準(zhǔn)中的腎陽虛癥狀

1.3 治療方法

溫和灸治療組(n=41):溫和灸腎俞穴、關(guān)元穴，每次治療取關(guān)元穴和單側(cè)腎俞穴，兩側(cè)交替，每穴每次灸20分鐘，每周治療3次，連續(xù)治療18次為一療程。

衰老對(duì)照組(n=40):衰老對(duì)照，不做治療。

1.4 療效判定標(biāo)準(zhǔn)

(1)衰老癥狀觀察

對(duì)溫和灸治療組治療前及第一、二療程結(jié)束時(shí)的臨床癥狀進(jìn)行觀察，同時(shí)觀察衰老對(duì)照組入組時(shí)及相當(dāng)兩療程結(jié)束時(shí)臨床癥狀的變化。參照《現(xiàn)代老年藥學(xué)》抗衰老藥物臨床評(píng)價(jià)中衰老癥狀積分標(biāo)準(zhǔn)［7］，每項(xiàng)癥狀記分之總和為衰老見證積分值。

問診:用統(tǒng)一的語句提問。凡主動(dòng)說出的癥狀記4分;提示問出的癥狀，凡癥狀顯著或持續(xù)出現(xiàn)，記3分;癥狀時(shí)輕時(shí)重或間斷出現(xiàn)，記2分;癥狀輕或偶爾出現(xiàn)，記1分;無癥狀為0分。

望診和脈診:具有癥狀中任意一項(xiàng)者記6分。(2)療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

參照第三次全國(guó)中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合老年醫(yī)學(xué)研究協(xié)作組會(huì)議制訂的《延緩衰老中藥的篩選規(guī)程和臨床觀察規(guī)范》附件中的療效判斷標(biāo)準(zhǔn)實(shí)行［6］。顯效:治療后衰老見證積分下降之值≥2/3治療前平均衰老見證積分值。有效:治療后衰老見證積分下降之值在1/3～2/3治療前平均衰老見證積分值之間。無效:治療后衰老見證積分下降之值≤1/3治療前平均衰老見證積分值。

1.5 外周血Rb蛋白表達(dá)檢測(cè)

溫和灸治療組第二療程結(jié)束時(shí)，采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)外周血Rb蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)檢測(cè)衰老對(duì)照組相當(dāng)兩療程結(jié)束時(shí)外周血Rb蛋白表達(dá)。抽取空腹靜脈血，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血Rb蛋白表達(dá)。取肝素抗凝外周血50μl。加10μl CD45-PC5，室溫孵育15分鐘。加100μl IntraPrep Reagent 1，劇烈振蕩混勻，室溫避光孵育15分鐘。加4 mlPBS-BSA，離心300 g/min 5分鐘，棄去上清液。加100μl IntraPrep Reagent 2，輕輕混勻，室溫避光孵育5分鐘。加入相應(yīng)劑量的一抗，Rb 2μl 10μl，輕輕混勻，室溫避光孵育 20分鐘。加4 ml PBS-BSA，離心300 g/min 5分鐘，棄去上清液，加入2μl二抗IgG-FITC，輕輕混勻，室溫避光孵育20分鐘。加4 ml PBS-BSA，離心300 g/min 5分鐘，棄去上清液。加1 ml PBS-BSA，重懸，上機(jī)檢測(cè)。同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照，只加CD45-PC5，其余抗體不加;陰性對(duì)照，加CD45-PC5和二抗或IgG1(mouse)-FITC。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組患者治療前后衰老癥狀積分符合正態(tài)分布，以表示，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。兩組間療效及療程間療效比較采用Ridit分析。外周血Rb蛋白表達(dá)符合正態(tài)分布，方差齊，用表示，采用單因素方差分析。P＜0.05被認(rèn)為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 衰老癥狀觀察

溫和灸治療組衰老癥狀積分最高46分，最低32 分，平均(39.50 ±3.70)，衰老對(duì)照組衰老癥狀積分最高45分，最低32分，平均(38.20±3.62)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，無顯著性差異。溫和灸治療組治療后與衰老對(duì)照組治療后比較衰老癥狀積分，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見表2。

表2 兩組腎陽虛老年人衰老癥狀積分比較(分，)

表2 兩組腎陽虛老年人衰老癥狀積分比較(分，)

組別 治療前 治療后溫和灸治療組39.50 ±3.70 19.80 ±5.12衰老對(duì)照組38.20 ±3.62 37.88 ±5.10

2.2 綜合療效情況

溫和灸第一療程末有效率53.66%，第二療程末有效率為90.24%，顯著優(yōu)于衰老對(duì)照組。經(jīng)Ridit分析，溫和灸治療組與衰老對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);且溫和灸治療第一療程療效與第二療程療效相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見表3。

表3 兩組綜合療效分析

2.3 溫和灸對(duì)老年人外周血單個(gè)核細(xì)胞Rb蛋白表達(dá)的影響

溫和灸治療組老年人外周血單個(gè)核細(xì)胞Rb蛋白陽性表達(dá)率顯著低于衰老對(duì)照組，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。選取溫和灸治療組患者30例在第二療程進(jìn)行外周血Rb蛋白表達(dá)檢測(cè)，選取衰老對(duì)照組患者30例在末次衰老癥狀評(píng)分時(shí)進(jìn)行外周血Rb蛋白表達(dá)檢測(cè)。兩組此次入選對(duì)象在人口學(xué)特征及入組時(shí)衰老癥狀積分情況無顯著性差異。見表4。

表4 溫和灸對(duì)老年人外周血單個(gè)核細(xì)胞Rb蛋白表達(dá)的影響(

表4 溫和灸對(duì)老年人外周血單個(gè)核細(xì)胞Rb蛋白表達(dá)的影響(

分組 n 陽性表達(dá)(%)溫和灸治療組30 57.70 ±9.57衰老對(duì)照組30 29.66 ±6.97

3 討論

《黃帝內(nèi)經(jīng)》將人類的生命全過程概括為“生、長(zhǎng)、壯、老、已”，衰老是這一過程中不可避免的階段。中醫(yī)理論認(rèn)為，腎為“先天之本”，主藏精，主生長(zhǎng)發(fā)育與生殖，生命過程隨腎氣旺盛而成長(zhǎng)，而后隨腎氣的衰弱而衰老。如《素問·上古天真論》記載:“丈夫八歲，腎氣實(shí)，發(fā)長(zhǎng)齒更;二八腎氣盛……三八腎氣平均……五八腎氣衰……八八天癸竭，精少，腎臟衰?！薄芭悠邭q，腎氣盛，齒更發(fā)長(zhǎng);二七而天癸至……三七腎氣平均……七七任脈虛，太沖脈衰少，天癸竭?！泵鞔輷辉凇夺t(yī)學(xué)正傳·命門主壽天》指出“腎氣盛則壽延，腎氣衰則壽夭”，均說明了腎虛是衰老的主要原因之一。

腎俞穴是背俞穴之一?！额惤?jīng)》中說“十二俞皆通于臟氣”。故腎俞為腎臟之氣輸通出入之處，具有調(diào)節(jié)和補(bǔ)充腎氣的作用，是延緩衰老的重要穴位。關(guān)元穴歸屬于任脈，又是小腸的募穴，足太陰脾經(jīng)、足少陰腎經(jīng)、足厥陰肝經(jīng)與任脈的交會(huì)穴。該穴位于下腹部，為男子藏精、女子蓄血之處。《扁鵲心書》曰:“每夏秋之交，即灼關(guān)元千壯，久久不畏寒暑。人至三十，可三年一灸臍下三百壯;五十，可二年一灸臍下三百壯;六十，可一年一灸臍下三百壯，令人長(zhǎng)生不老?！北徽J(rèn)為是保健要穴。關(guān)于腎俞穴、關(guān)元穴延緩衰老的相關(guān)研究有諸多報(bào)道，證實(shí)通過刺激此二穴可調(diào)節(jié)機(jī)體的自由基、免疫、內(nèi)分泌等系統(tǒng)功能，從而延緩衰老［8-11］。

溫和灸是艾灸的一種，具有簡(jiǎn)便易行、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、無毒副作用、不易產(chǎn)生耐受性等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)多種與腎氣虧虛相關(guān)的疾病具有治療作用［12，13］。本次研究結(jié)果顯示溫和灸關(guān)元、腎俞對(duì)衰老(腎陽虛性)療效肯定，可以改善老年人腎陽虛證相關(guān)癥狀，且不同療程療效差異顯著，因此在老年人群的健康管理中可發(fā)揮積極作用。

衰老的發(fā)生可能由許多種信號(hào)觸發(fā)，其中Rb、P53、P16等抑癌基因是細(xì)胞衰老的關(guān)鍵效應(yīng)物，是細(xì)胞衰老調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的主要環(huán)節(jié)和關(guān)鍵靶點(diǎn)。Rb為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤腫瘤抑制基因，定位于人13號(hào)染色體的長(zhǎng)臂1區(qū)4帶(13q14)。大量文獻(xiàn)表明，Rb與衰老密切相關(guān)，在細(xì)胞衰老中起著重要的作用。Rb蛋白功能的發(fā)揮主要受到磷酸化/去磷酸化的控制。在磷酸化狀態(tài)下，其蛋白活性喪失［14］;而在衰老的細(xì)胞中，Rb以其活性的低磷酸化的生長(zhǎng)抑制形式存在［15］。研究表明Rb在衰老細(xì)胞與年輕細(xì)胞中的表達(dá)并無明顯變化，但Rb蛋白的存在形式不同，在衰老細(xì)胞中Rb主要以非磷酸化形式存在，因?yàn)樵诩?xì)胞周期調(diào)控中，低磷酸化Rb構(gòu)成細(xì)胞周期的R點(diǎn)，維持細(xì)胞在G0期和G1期，抑制細(xì)胞分裂。Rb蛋白磷酸化后使細(xì)胞從上述限制中釋放出來，進(jìn)入S期。可見，Rb蛋白的磷酸化狀態(tài)與細(xì)胞增值分裂密切相關(guān)［16］。同時(shí)Rb與周期素依賴性蛋白激酶負(fù)調(diào)控因子(CKIs)的Ink4家族和Kip家族各成員在調(diào)控細(xì)胞衰老的過程中相互影響，是調(diào)控肌體衰老的重要信號(hào)途徑之一［15，17-21］。

在以往的研究中，已觀察到溫和灸腎俞穴能降低自然衰老大鼠肝組織Rb mRNA及蛋白表達(dá)［22］。本臨床研究結(jié)果顯示:溫和灸治療組老年人外周血單個(gè)核細(xì)胞Rb蛋白陽性表達(dá)率均顯著低于衰老對(duì)照組。表明溫和灸可能通過抑制老年人外周血單個(gè)核細(xì)胞Rb的表達(dá)，改善衰老相關(guān)癥狀，降低衰老見證積分。具體調(diào)節(jié)路徑仍需進(jìn)一步臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。

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(本文編輯:秦楠)

ZHAO Chen，E-mail:chris_0127@126.com

Objective To explore the anti-aging effect of suspended moxibustion on the Rb expressions of the peripheral blood and general symptoms in aged people.Methods A total of 81 elderly people were enrolled.The aged people between 60-75 years old were randomly divided into two groups including 41 in suspended moxibustion group and 40 in aging control group.Suspended moxibustion on points Shenshu(BL23)and Guanyuan(CV4)were applied to the treated group under treatment for two courses.The effects of suspended moxibustion on aging symptom of aged people were observed with integral table.The total effective rate of suspended moxibustion was assessed by symptom scores，and the Rb expression of the peripheral blood was measured by flow cytometry.Results (1)Symptoms of aging integral of suspended moxibustion group was significantly reduced than that in the aging control group(P＜0.01);(2)The effect of suspended moxibustion group in the second course was significantly improved than that in the first course(P ＜0.01).(3)The Rb expression rates of the peripheral blood in suspended moxibustion group were lower than that in the aging group(P ＜0.01).Conclusion The anti-aging effect of suspended moxibution may be through decreasing the pRb expression of the peripheral blood in aged people.

Suspended moxibustion;Aging;Retinoblastoma protein;Clinical study

趙琛(1973－)，女，博士，副主任醫(yī)師。研究方向:針灸免疫研究。E-mail:chris_0127@126.com

R246

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2012.05.008

2012-02-17)

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(2009CB522900);國(guó)家自然科學(xué)基金(30701124);上海市重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(S30304)

200437上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院針灸科(趙琛、劉慧榮);上海中醫(yī)藥大學(xué)針灸免疫三級(jí)實(shí)驗(yàn)室(施茵、崔云華、王曉梅、馬曉芃、吳蓓玲、吳璐一)