趙宏麗 趙俊芳 李孟娟

CD4+IL-10+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在特應(yīng)性皮炎患者中的改變

趙宏麗 趙俊芳 李孟娟

目的：探討特應(yīng)性皮炎（AD）患者外周血CD4+IL-10+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、白細(xì)胞介素（IL）-10及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β的改變。方法：用流式細(xì)胞儀直接免疫熒光法檢測(cè)86例AD患者（AD組）外周血CD4+IL-10+T細(xì)胞的絕對(duì)計(jì)數(shù)和百分率；用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)外周血細(xì)胞因子IL-10、TGF-β的濃度，并與67例健康體檢者（對(duì)照組）比較。結(jié)果：AD患者CD4+IL-10+T細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)和占CD4+T細(xì)胞的百分率及血IL-10濃度均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。2組TGF-β濃度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。AD患者CD4+IL-10+T細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)與外周血IL-10濃度呈正相關(guān)（r=0.47，P<0.05）；而與外周血TGF-β無(wú)相關(guān)性（r=0.15，P>0.05）。CD4+IL-10+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分率與外周血IL-10濃度呈正相關(guān)（r=0.65,P<0.05）；而與外周血TGF-β無(wú)相關(guān)性（r=0.21,P>0.05）。結(jié)論：IL-10可能是I型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Trl）發(fā)揮功能的主要因子，通過(guò)下調(diào)由Th1和Th2細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)過(guò)程，參與免疫調(diào)節(jié)。

皮炎，特應(yīng)性 T淋巴細(xì)胞,調(diào)節(jié)性 白細(xì)胞介素10轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β

特應(yīng)性皮炎（atopic dermatitis,AD）是一種慢性、復(fù)發(fā)性、瘙癢性、炎癥性皮膚病。患病率呈逐年上升趨勢(shì)，目前普遍認(rèn)為其是一種遺傳、環(huán)境、免疫系統(tǒng)相互作用的多因素疾病，但發(fā)病機(jī)制尚未明確。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（T-regulatory cell，Tr）是一群獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，具有免疫抑制作用，尤其是CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。Tr在正常人體生理穩(wěn)態(tài)的維持以及在腫瘤、器官移植、自身免疫性疾病及病毒感染等病理狀態(tài)均起重要作用，與AD的免疫病理過(guò)程和病情密切相關(guān)[1-2]。本研究旨在通過(guò)檢測(cè)AD患者外周血CD4+IL-10+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、白介素（IL）-10及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β的改變，探討Tr在AD患者中的免疫病理機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2009年10月—2010年10月在我院變態(tài)反應(yīng)科門(mén)診診療的AD患者86例（AD組），其中男47例，女39例，年齡11~39歲，平均（27.31±8.5）歲，平均病程（5.6±2.8）年，均來(lái)自天津地區(qū)，漢族，診斷符合文獻(xiàn)[3]的診斷標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照組67例為天津地區(qū)健康獻(xiàn)血員，男37例，女30例，年齡21~41歲，平均（35.3±9.3）歲。2組間性別（χ2=0.01），年齡（t=0.97）比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

1.2 方法 （1）CD4+IL-10+T細(xì)胞檢測(cè)：無(wú)菌采集外周靜脈血10 mL，肝素鈉抗凝，F(xiàn)icoll淋巴細(xì)胞分層液的密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，移入RPMI1640（含10%胎牛血

清）培養(yǎng)基中，加20 μg/L植物血凝素（PHA）刺激，37℃ 、5%CO2培養(yǎng)24 h。收集培養(yǎng)液中細(xì)胞于流式反應(yīng)管中，加入抗CD4-PE抗體20 μL，混勻，4℃避光孵育30 min；加入1 mL破膜劑，避光孵育45 min；加入抗IL-10-FITC抗體，室溫避光20 min，PBS洗滌重懸后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。各項(xiàng)數(shù)據(jù)分析采用CellQuest軟件進(jìn)行，根據(jù)前向散射光和側(cè)向散射光調(diào)節(jié)PMT1和PMT2，以相應(yīng)同型IgG染色細(xì)胞作為陰性對(duì)照調(diào)節(jié)熒光補(bǔ)償（FL）1和FL2。（2）外周血IL-10、TGF-β檢測(cè)：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)試劑盒購(gòu)自晶美生物工程有限公司。用酶標(biāo)儀（SPECTRⅢ，奧地利）讀取吸光度值，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，吸光度值作縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以樣品吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩獨(dú)立樣本比較采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析用Pearson相關(guān)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組CD4+IL-10+T細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果 AD患者CD4+IL-10+T細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)和占CD4+T細(xì)胞的百分率均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

Table 1 Comparison of CD4+IL-10+regulatory T cells,IL-10 and TGF-β between two groups表1 2組CD4+IL-10+T細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果、血IL-10及TGF-β水平比較 （）

Table 1 Comparison of CD4+IL-10+regulatory T cells,IL-10 and TGF-β between two groups表1 2組CD4+IL-10+T細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果、血IL-10及TGF-β水平比較 （）

*P<0.05

組別 n AD組對(duì)照組t 86 67 CD4+IL-10+T絕對(duì)計(jì)數(shù)（×109/L）0.26±0.13 0.02±0.01 3.56*占CD4+T細(xì)胞的百分率（%）12.76±4.85 3.27±1.03 2.29*IL-10（ng/L）126.59±59.46 31.47±10.96 2.81*TGF-β（ng/L）407.23±155.88 359.47±99.21 1.33

2.2 2組外周血IL-10、TGF-β檢測(cè)結(jié)果比較 AD患者外周血IL-10濃度高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。2組TGF-β濃度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表1。

2.3 AD患者CD4+IL-10+T細(xì)胞與外周血IL-10、TGF-β的相關(guān)性分析 AD患者CD4+IL-10+T細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)與外周血IL-10濃度呈正相關(guān)（r=0.47,P<0.05）；而與外周血TGF-β無(wú)相關(guān)性（r=0.15,P>0.05）。CD4+IL-10+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分率與外周血IL-10濃度呈正相關(guān)（r=0.65,P<0.05）；而與外周血TGF-β無(wú)相關(guān)性（r=0.21,P>0.05）。

3 討論

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是一類具有主動(dòng)免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞群，根據(jù)來(lái)源和表型不同可將CD4+Tr分為CD4+CD25+T細(xì)胞、Ⅰ型Tr（Tr1）細(xì)胞和輔助性T細(xì)胞3（Th3）等亞類。Tr1細(xì)胞不表達(dá)Foxp3，但活化后可上調(diào)Foxp3水平，與活化的CD4+CD25-T細(xì)胞表達(dá)Foxp3的現(xiàn)象類似[4]。Cobbold等[5]研究鼠類Tr1和CD4+CD25+Tr，發(fā)現(xiàn)Tr1可選擇性地表達(dá)ROG（GATA-3的抑制劑），但活化的Th細(xì)胞也表達(dá)ROG。故目前尚未發(fā)現(xiàn)Tr1細(xì)胞的特異性標(biāo)志，難以將其與CD4+CD25+Tr區(qū)分。Trl主要通過(guò)分泌IL-10、TGF-β抑制初始型和記憶型T細(xì)胞反應(yīng)，且其抑制作用需要T細(xì)胞受體（TCR）的激活。IL-10下調(diào)細(xì)胞表面共刺激分子和抗原提呈細(xì)胞（APC）表達(dá)的促炎因子，直接抑制CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生IL-2和腫瘤壞死因子（TNF）α。TGF-β同樣抑制APC的功能和T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的能力。在加入抗IL-10和抗TGF-β的中和抗體后，Tr1的抑制作用部分或全部消失。

Szegedi等[6]研究顯示，在AD組和對(duì)照組中，Tr1的絕對(duì)數(shù)量和百分比均有差異，但2組CD4+CD25+Tr無(wú)差異。Ver?hagen等[7]通過(guò)對(duì)皮膚組織的免疫組化研究發(fā)現(xiàn)，盡管AD患者皮損區(qū)、特應(yīng)性斑貼試驗(yàn)皮損區(qū)Tr1細(xì)胞及其抑制性細(xì)胞因子IL-10表達(dá)明顯增加，但沒(méi)有CD4+CD25+Tr細(xì)胞，提示調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的缺陷參與了AD的發(fā)病機(jī)制。Keppel等[8]從治療方面的研究顯示患AD的犬接受免疫治療后，CD4+CD25+Tr及IgE數(shù)量減少，IL-10數(shù)量增多。間接反映AD中CD4+CD25+Tr的數(shù)量是增加的。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)AD患者Tr的研究結(jié)果存在一定差異，可能是因?yàn)檠芯糠椒安±x擇和分期不同。本研究結(jié)果提示，AD患者外周血中Tr1細(xì)胞數(shù)量和IL-10增加，IL-10可能是導(dǎo)致Tr1發(fā)揮功能的主要因子，能夠下調(diào)由Th1和Th2細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)過(guò)程，參與免疫調(diào)節(jié)[9-10]。因此，隨著對(duì)AD患者體內(nèi)調(diào)節(jié)性細(xì)胞的深入研究，可能會(huì)進(jìn)一步揭示AD的發(fā)病機(jī)制，為臨床診斷、治療與預(yù)防提供重要的理論依據(jù)。

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10.3969/j.issn.0253-9896.2012.08.023

300120天津市長(zhǎng)征醫(yī)院

（2011-08-04收稿 2011-11-21修稿）

（本文編輯 閆娟）