蔡澤園 趙莉莉 張 蕊 毛用敏 崔讓莊

-514 bp及-250 bp位點(diǎn)基因多態(tài)性對(duì)肝脂酶轉(zhuǎn)錄活性的影響

蔡澤園 趙莉莉 張 蕊 毛用敏 崔讓莊

目的：探討同時(shí)含肝脂酶（HL）啟動(dòng)子-514 bp和-250 bp多態(tài)位點(diǎn)的野生型及變異純合子型的熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒對(duì)HL轉(zhuǎn)錄活性的影響。方法：PCR法擴(kuò)增含不同目的基因的DNA片段，將目的基因插入到pUCm-T質(zhì)粒中，獲取含SacI及BglⅡ酶切位點(diǎn)的目的基因，將該基因與含熒光素報(bào)告基因的pGL2質(zhì)粒相連，構(gòu)建pGL2-HL/-514T+-250A變異純合型以及pGL2-HL/-514C+-250G野生型熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)不同重組質(zhì)粒熒光素酶報(bào)告基因的活性。結(jié)果：（1）實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了同時(shí)含HL啟動(dòng)子部位-514/-250位點(diǎn)的野生型和變異純合型的熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒。（2）pGL2-HL/-514T+-250A變異純合型的熒光素酶相對(duì)表達(dá)活性明顯低于野生型熒光素酶表達(dá)活性（P<0.01）。結(jié)論：HL啟動(dòng)子-514及-250位置基因的聯(lián)合變異可直接影響HL的轉(zhuǎn)錄活性。

肝脂酶 啟動(dòng)區(qū)（遺傳學(xué)） 多態(tài)現(xiàn)象,遺傳 雜合子 純合子 轉(zhuǎn)錄,遺傳 基因表達(dá)

肝脂酶（HL）是脂蛋白代謝的關(guān)鍵酶之一，HL基因啟動(dòng)子區(qū)單核苷酸基因多態(tài)性與糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化等多種疾病有相關(guān)性[1-3]，并與HL活性下降有關(guān)，尤其是-514T和-250A等位基因攜帶者存在HL活性下降的現(xiàn)象[4]。由于HL上述4個(gè)位點(diǎn)基因多態(tài)性存在著連鎖不平衡[5]，本研究擬構(gòu)建同時(shí)含HL基因啟動(dòng)子-514多態(tài)性位點(diǎn)與-250多態(tài)性位點(diǎn)的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)熒光素酶報(bào)告基因的熒光強(qiáng)度，以探討啟動(dòng)子不同位點(diǎn)的基因變異對(duì)轉(zhuǎn)錄活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 Taq DNA聚合酶、大腸桿菌菌株DH5α、pUCm-

Teasy載體、pGL2-Basic載體（上海生工生物工程有限公司）；人肝癌細(xì)胞系細(xì)胞（HepG2）購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；DMEM培養(yǎng)基（HG-DMEM）、胎牛血清、0.5%胰蛋白酶、青霉素/鏈霉素（GIBCO公司）；DNA Marker DL2000、T4DNA連接酶、限制性?xún)?nèi)切酶SacⅠ、BglⅡ（大連寶生物工程有限公司）；胰蛋白胨（天津市東方衛(wèi)生材料廠）；酵母菌提取物（華美生物工程公司）；細(xì)菌瓊脂粉、瓊脂糖（上海基因科技有限公司）；PCR儀（Gene Amp PCR system 9600）、光度測(cè)定計(jì)（Eppen?dorf公司）；ZF型紫外透射反射分析儀（上?？等A生化儀器制造廠）；倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；層流超凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）；熒光化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀（Applied Biosystems公司）。

1.2 方法 模板：含HL-514C+-250G野生型以及HL-514T+-250A變異純合子的基因組DNA標(biāo)本由本室保存。引物：上游 5'-TCTAGGATCACCTCTCAATGGGTCA-3'，下游5'-GGGGTCCAGGCTTTCTTGG-3'，由上海生工生物工程有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系及參數(shù)：25 μL反應(yīng)體系中各物質(zhì)的濃度為 300 mmol/L Tris-HCl，75 mmol/L（NH4）2SO4，pH 9.5，12.5 mmol/L MgCl2，20 μmol/L上游引物和下游引物，10 mmol/L dNTP，0.25 μL Taq酶；0.5 μL DNA，反應(yīng)條件：95 ℃5 min。以下步驟35個(gè)循環(huán)：95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，72℃7 min。純化回收PCR產(chǎn)物，與pUCm-T連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，堿裂解法提取質(zhì)粒，限制性?xún)?nèi)切酶MvaI對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，進(jìn)行DNA序列測(cè)定（三博遠(yuǎn)志生物公司）。利用pUCm-T和pGL2-Basic共有的限制性?xún)?nèi)切酶SacⅠ和BglⅡ酶切pUC-HL/-514C+-250G及pUC-HL/-514T+-250A重組質(zhì)粒和pGL2-Basic，隨后進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒，限制性?xún)?nèi)切酶SacⅠ、BglⅡ?qū)χ亟M質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，并進(jìn)行DNA序列測(cè)定。用陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectamine 2000將pGL2-HL/-514C+-250G及pGL2-HL/-514T+-250A重組質(zhì)粒（1 μg/孔）分別和內(nèi)參質(zhì)粒PRL-nuL l（0.025 μg/孔）共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞（按Lipofectamine 2000操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行）。細(xì)胞轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h后裂解細(xì)胞，收集裂解液，細(xì)胞裂解液20 μL與LARⅡ100 μL混合，在熒光發(fā)光檢測(cè)儀讀取10 s的發(fā)光值，此為螢火蟲(chóng)熒光素酶催化產(chǎn)生的發(fā)光強(qiáng)度。再加入Stop＆Glo 100 μL終止螢火蟲(chóng)熒光素酶活性，讀取10 s發(fā)光值，即為海腎熒光素酶催化產(chǎn)生的發(fā)光強(qiáng)度。記錄檢測(cè)數(shù)據(jù)，計(jì)算不同重組質(zhì)粒熒光素酶相對(duì)活性。熒光素酶相對(duì)活性的計(jì)算公式如下：熒光素酶相對(duì)活性=（螢火蟲(chóng)熒光素酶發(fā)光強(qiáng)度-空白孔發(fā)光強(qiáng)度）÷（海腎熒光素酶發(fā)光強(qiáng)度-空白孔發(fā)光強(qiáng)度）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pUC-HL/-514C+-250G及pUC-HL/-514T+-250A重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 構(gòu)建成功的pUC-HL/-514C+-250G及pUC-HL/-514T+-250A重組質(zhì)粒，經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定，由于pUCm-T質(zhì)粒上有2個(gè)MvaI的酶切位點(diǎn)，同時(shí)插入的目的片段中亦存在1個(gè)MvaI的酶切位點(diǎn)，故正向插入的重組質(zhì)粒酶切后產(chǎn)生546 bp和212 bp兩條片段，見(jiàn)圖1。DNA測(cè)序顯示，重組質(zhì)粒中含有相應(yīng)的基因多態(tài)性位點(diǎn)，其他序列無(wú)變異，pUC-HL/-514C+-250G及pUC-HL/-514T+-250A重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，見(jiàn)圖2。

2.2 pGL2-HL/-514C+-250G及pGL2-HL/-514T+-250A重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 構(gòu)建好的pGL2-HL/-514C+-250G和pGL2-HL/-514T+-250A質(zhì)粒，用限制性?xún)?nèi)切酶SacⅠ、BglⅡ進(jìn)行雙酶切，切下與插入片段大?。?96 bp）一致的DNA片段，見(jiàn)圖3。DNA測(cè)序結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒中含有相應(yīng)的基因多態(tài)性位點(diǎn)，其他序列無(wú)變異，pGL2-HL/-514C+-250G和pGL2-HL/-514T+-250A質(zhì)粒構(gòu)建成功，見(jiàn)圖4。

Figure 1 Electrophoresis of enzyme digestion of pUC-HL/-514+-250 recombinant plasmid DNA圖1 pUC-HL/-514+-250重組質(zhì)粒酶切電泳圖

Figure 3 Electrophoresis of enzyme digestion of pGL2-HL/-514+-250 recombinant plasmid圖3 pGL2-HL/-514+-250重組質(zhì)粒酶切電泳圖

2.3 熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè) pGL2-HL/-514C+-250G質(zhì)粒中的熒光素酶相對(duì)活性高于pGL2-HL/-514T+-250A質(zhì)粒中的熒光素酶相對(duì)活性（9.835±2.462 vs 4.726±1.077），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.658，P ＜ 0.01）。

3 討論

肝脂酶基因啟動(dòng)子區(qū)域有4種常見(jiàn)的基因多態(tài)性，在不同種族人群中此4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)幾乎成完全連鎖不平衡。研究證實(shí)，其中的-514T位點(diǎn)與-250位點(diǎn)基因多態(tài)性與肝脂酶活性降低及血漿HDL-C濃度變化相關(guān)[6-7]。Deeb等[8]通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，將含有HL基因啟動(dòng)子-514C與-250G及HL基因啟動(dòng)子-514T與-250A的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染進(jìn)人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞及大鼠的肝細(xì)胞系A(chǔ)ML12細(xì)胞，比較野生型HL基因啟動(dòng)子與-514位點(diǎn)及-250位點(diǎn)均為變異型的HL基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，結(jié)果顯示，2種重組質(zhì)粒在HepG2細(xì)胞中的活性很低以至于很難區(qū)分2種重組體的轉(zhuǎn)錄活性，可是2種重組質(zhì)粒在AML12細(xì)胞中卻表現(xiàn)出很高的活性，HL-514T/-250A的活性比HL-514C/-250G要低30%。目前國(guó)內(nèi)通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)方法對(duì)HL啟動(dòng)子區(qū)基因多態(tài)性與轉(zhuǎn)錄活性的研究尚少見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了pGL2-HL/-514C+-250G及pGL2-HL/-514T+-250A重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞中以檢驗(yàn)兩者的轉(zhuǎn)錄活性及差別，與Deeb等[8]研究不同的是2種重組質(zhì)粒在HepG2細(xì)胞中都得以高效地表達(dá)，分析原因可能是本實(shí)驗(yàn)采用了含熒光素酶報(bào)告基因的pGL2-Basic載體，而Deeb等采用的是pXP1載體，由于載體不同而導(dǎo)致在同樣的細(xì)胞內(nèi)其轉(zhuǎn)錄活性卻相差巨大。

本研究通過(guò)構(gòu)建pGL2含多態(tài)性目的片段的重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞中，可能為體外研究目的基因啟動(dòng)子多態(tài)性與轉(zhuǎn)錄功能的關(guān)系找到一種有效的途徑，但本研究只對(duì)HL基因啟動(dòng)子區(qū)-514及-250兩個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性與轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)系做了比較，常見(jiàn)的其他兩個(gè)位點(diǎn)的研究尚有待深入。

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The effect of Hepatic Lipase Gene Promoter Polymorphisms on the Transcriptional Activity

CAI Zeyuan,ZHAO Lili,ZHANG Rui,MAO Yongmin,CUI Rangzhuang

Tianjin Chest Hospital,Tianjin 30051,China

Objective:To investigate the effect of recombinant plasmids containing the double luciferase report gene and the hepatic lipase(HL)promoter-514/-250 sites on HL transcriptional activity.Methods:DNA fragments containing different target genes were amplified by PCR.Target genes were inserted into the plasmid pUCm-T to obtain the target gene containing SacI and BglⅡrestriction sites.The luciferase reporter vectors containing HL promoter-514T/-250A and-514C/-250G polymorphisms were constructed,and tested by Dual Luciferase Reporter Assay System.Results:The lu?ciferase reporter vector containing HL promoter-514T+-250A presented higher HL transcriptional activity than that of vec?tor with-514C+-250G（P<0.01）.Conclusion:HL promoter-514C together with-250G alleles were associated with high?er HL transcriptional activity,which proved that HL promoter polymorphisms can influence the HL transcriptional activity in the molecular mechanism.

hepatic lipase promoter regions(genetics) polymorphism,genetic heterozygote homozygote tran?scription,genetic gene expression

10.3969/j.issn.0253-9896.2012.08.016

300051 天津市胸科醫(yī)院心血管病研究所

（2011-09-01收稿 2011-12-01修回）

（本文編輯 陸榮展）