賀豐杰 李小寧 張 倩 白 俊

凋膜止崩液對(duì)無(wú)排卵性功血大鼠子宮內(nèi)膜組織ER、ERα及ERβ表達(dá)的影響*

賀豐杰 李小寧 張 倩 白 俊

目的：探討凋膜止崩液宮腔靶向給藥治療無(wú)排卵性功能失調(diào)性子宮出血（功血）子宮內(nèi)膜增生癥的可能機(jī)制。方法：選取健康成年SD雌性大鼠48只，分為空白組、模型對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)小劑量組和實(shí)驗(yàn)大劑量組，建立無(wú)排卵性功血子宮內(nèi)膜增生癥模型。凋膜止崩液宮腔內(nèi)給藥后3 d處死，留取子宮標(biāo)本，采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)各組大鼠子宮內(nèi)膜組織中雌激素受體（ER）、ERα及ERβ的表達(dá)水平。結(jié)果：模型對(duì)照組ER、ERα、ERβ的表達(dá)高于空白組，實(shí)驗(yàn)大、小劑量組ER、ERα、ERβ的表達(dá)低于模型對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001），實(shí)驗(yàn)大劑量組ER、ERα和ERβ水平低于實(shí)驗(yàn)小劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論：凋膜止崩液通過(guò)下調(diào)ER、ERα及ERβ阻斷了雌激素發(fā)揮效應(yīng)的通路，抑制子宮內(nèi)膜的持續(xù)性增生從而治療子宮內(nèi)膜增生癥。

功能性子宮出血 子宮內(nèi)膜增生 受體,雌激素 雌激素受體α 雌激素受體β 凋膜止崩液

子宮內(nèi)膜增生癥是無(wú)排卵性功能失調(diào)性子宮出血（功血）常見(jiàn)的病理類(lèi)型，是一種激素依賴(lài)性疾病。由于異常大量子宮出血常導(dǎo)致貧血，并且病理學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜從超出正常增生期到癌前的增生形成一個(gè)連續(xù)的譜[1]，屬于婦科疑難病癥。增生的子宮內(nèi)膜含有雌激素受體（ER），ER有ERα和ERβ 2種亞型，ER及其亞型在子宮內(nèi)膜增生癥的發(fā)展過(guò)程中起重要作用[2]。本研究通過(guò)建立子宮內(nèi)膜增生癥大鼠模型，探討ER及其亞型在子宮內(nèi)膜增生癥發(fā)病中的作用，并通過(guò)中藥凋膜止崩液宮腔靶向治療，觀察在用藥后ER及其亞型在子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)變化，從而揭示凋膜止崩液治療子宮內(nèi)膜增生癥的可能機(jī)制，為臨床推廣中藥宮腔靶向治療無(wú)排卵性功血提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立及分組 健康成年SD雌性大鼠48只，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，將大鼠隨機(jī)分成空白組、模型對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)小劑量組和實(shí)驗(yàn)大劑量組，每組12只。造模：空白組僅行開(kāi)關(guān)腹手術(shù)，其余3組大鼠均去掉卵巢組織，術(shù)后3d，空白組大鼠肌內(nèi)注射花生油1.5 μL/g，其余3組大鼠均肌內(nèi)注射苯甲酸雌二醇1.5 μL/g，隔日1次，連續(xù)14次后各組隨機(jī)處死2只取其子宮內(nèi)膜組織，經(jīng)病理證實(shí)為子宮內(nèi)膜增生癥，表示造模成功。每組剩余10只大鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，3 d后，模型對(duì)照組大鼠雙側(cè)子宮腔注入生理鹽水0.6 mL（0.3 mL/側(cè)）；小劑量組大鼠注入凋膜止崩液0.6 mL（0.001 6 g/mL，0.3 mL/側(cè)）；大劑量組大鼠注入0.6 mL（0.003 3 g/mL，0.3 mL/側(cè)）。宮腔注藥3 d后處死。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 凋膜止崩液由鴉膽子、莪術(shù)及元胡3味藥物組成，由陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系提供，經(jīng)生藥學(xué)鑒定符合中國(guó)藥典2005年版規(guī)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。提取有效部位群（鴉膽子提取鴉膽子油、莪術(shù)提取莪術(shù)油）。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)，按照提取物∶乳化液∶生理鹽水=1∶1∶8的比例加入吐溫-80和生理鹽水，配成乳化劑。用藥劑量按照人∶大鼠=6.25∶1的比例給予。苯甲酸雌二醇針劑（1 g/L），上海第九制藥廠。兔抗人、大鼠、小鼠ER、ERα、ERβ多克隆抗體及免疫組化SP-0023分析藥盒購(gòu)自西安阿爾寶生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3 子宮內(nèi)膜ER、ERα、ERβ測(cè)定 采用免疫組化染色SP法，檢測(cè)程序按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。取大鼠子宮組織，立即置于4%多聚甲醛固定液中，常規(guī)脫水、石蠟包埋，統(tǒng)一切片后，加入一抗、二抗、辣根酶標(biāo)鏈霉素，最后用DAB染色。用已知表達(dá)ER、ERα、ERβ的乳腺癌組織切片作陽(yáng)性對(duì)照[1]，用PBS代替一抗作陰性對(duì)照，結(jié)果判斷以上皮細(xì)胞核出現(xiàn)黃色或棕褐色顆粒為陽(yáng)性反應(yīng)，每張組織切片取5個(gè)高倍視野（×200倍），每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率，取平均百分率為顯色指數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織中ER、ERα及ERβ的表達(dá)水平比較 模型對(duì)照組的ER、ERα、ERβ表達(dá)水平高于空白組，實(shí)驗(yàn)大、小劑量組的ER、ERα、ERβ表達(dá)水平低于模型對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001），實(shí)驗(yàn)大劑量組的ER、ERα和ERβ水平低于實(shí)驗(yàn)小劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001）。

Table 1 Comparison of expressions of ER,ER α and ER βbetween four groups表1 各組ER、ERα及ERβ表達(dá)水平比較 （%）

Table 1 Comparison of expressions of ER,ER α and ER βbetween four groups表1 各組ER、ERα及ERβ表達(dá)水平比較 （%）

**P<0.01

組別空白組模型對(duì)照組實(shí)驗(yàn)小劑量組實(shí)驗(yàn)大劑量組F n 10 10 10 10 ER 35.17±2.63 65.82±2.52 43.91±4.37 40.36±3.89 182.33**ERα 37.24±2.37 78.64±2.15 44.72±3.99 40.23±3.46 410.01**ERβ 39.74±2.56 76.43±2.91 40.07±4.06 37.23±3.28 311.01**

2.2 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織中ER、ERα及ERβ的表達(dá) 對(duì)于ER、ERα和ERβ，均是空白組陽(yáng)性細(xì)胞呈少量、散在分布；模型對(duì)照組中呈現(xiàn)較多含棕黃色顆粒的陽(yáng)性細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)小劑量組均可見(jiàn)少量白細(xì)胞浸潤(rùn)，陽(yáng)性細(xì)胞較模型對(duì)照組減少；實(shí)驗(yàn)大劑量組內(nèi)膜上皮脫失，腺體消失，可見(jiàn)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，偶見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞，見(jiàn)圖1~3。

Figure 1 The expression of ER in uterine tissues of four groups（Immunohistochemistry×200）圖1 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織中ER的表達(dá)（免疫組化×200）

Figure 2 The expression of ERα in uterine tissues of four groups（Immunohistochemistry×200）圖2 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織中ERα的表達(dá)（免疫組化×200）

3 討論

Figure 3 The expression of ERβ in uterine tissues of four groups（Immunohistochemistry×200）圖3 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織中ERβ的表達(dá)（免疫組化×200）

子宮內(nèi)膜增生癥是由于神經(jīng)內(nèi)分泌失調(diào)導(dǎo)致卵巢無(wú)排卵，子宮內(nèi)膜長(zhǎng)期受單一雌激素刺激無(wú)孕酮拮抗形成病理性增生過(guò)度。雌激素在女性生殖功能中起不可替代的作用，它主要通過(guò)與ER結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)作用。人類(lèi)的ERα和ERβ有相同的外顯子，但ERβ對(duì)雌二醇的親和力較ERα低[3]，提示很可能在循環(huán)雌二醇濃度升高時(shí)ERβ才被激活。錢(qián)洪浪等[2]在對(duì)絕經(jīng)過(guò)渡期女性子宮內(nèi)膜病變ERα、ERβ的研究中發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜過(guò)度增生組ERα的表達(dá)較增生期子宮內(nèi)膜增加，而ERβ的表達(dá)無(wú)明顯改變。因此子宮內(nèi)膜的增殖作用主要是通過(guò)ERα途徑介導(dǎo)的，ERβ的確切作用不明[4]。王言奎等[5]研究表明在增生子宮內(nèi)膜組中ERβ mRNA的平均表達(dá)水平高于正常子宮內(nèi)膜組，ERβ mRNA的升高與子宮內(nèi)膜增生的發(fā)病相關(guān)。ERβ在促進(jìn)子宮內(nèi)膜過(guò)度增生乃至進(jìn)一步癌變方面發(fā)揮著作用[3]。以上研究表明ERα、ERβ與子宮內(nèi)膜增生癥的發(fā)病有密切聯(lián)系。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)切除大鼠卵巢，排除了卵巢排卵和孕激素的影響，利用雌激素負(fù)荷法單一刺激大鼠，建立起無(wú)排卵性功血子宮內(nèi)膜增生癥大鼠模型。既往研究證實(shí)，雌激素一方面促進(jìn)內(nèi)膜細(xì)胞增生和血管增殖，另一方面可以使內(nèi)膜細(xì)胞增生過(guò)程中在DNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄水平上誘導(dǎo)ER的生成[6]。本實(shí)驗(yàn)中模型對(duì)照組與空白組比較，ER、ERα、ERβ表達(dá)均明顯升高，也表明雌激素可以促進(jìn)ER及其α、β亞型的合成，從而更有利于雌激素發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。隨著對(duì)ER研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)激素靶器官對(duì)激素的反應(yīng)不僅取決于循環(huán)中的激素濃度，也取決于靶器官中受體的含量[7]。所以當(dāng)激素水平或子宮內(nèi)膜組織相應(yīng)的受體含量改變或受體功能異常時(shí)，都可能造成子宮內(nèi)膜形態(tài)和功能上的病理改變。低水平的雌激素可以因?yàn)樽訉m內(nèi)膜中ER含量增高而發(fā)病[8]。在本實(shí)驗(yàn)中模型大鼠ER及其α、β亞型含量的升高，合力誘發(fā)了子宮內(nèi)膜增生癥。

中醫(yī)認(rèn)為，無(wú)排卵性功血辨病為崩漏，證屬血瘀，治宜活血化瘀。凋膜止崩液由鴉膽子、莪術(shù)、元胡3味中藥組成，具有活血化瘀、祛腐散結(jié)的作用。本實(shí)驗(yàn)使用凋膜止崩液靶向用藥于大鼠宮腔，其結(jié)果顯示，在同一時(shí)期大鼠增生子宮內(nèi)膜組織中，用藥后大、小劑量組大鼠ER、ERα、ERβ表達(dá)水平均較模型對(duì)照組明顯下降。推測(cè)凋膜止崩液可能是通過(guò)下調(diào)ER、ERα、ERβ的含量，切斷了雌激素發(fā)揮效應(yīng)的途徑，從而抑制子宮內(nèi)膜持續(xù)生長(zhǎng)，達(dá)到治療子宮內(nèi)膜增生癥的目的。凋膜止崩液下調(diào)ER及其亞型的具體原因不明，既往文獻(xiàn)中未見(jiàn)鴉膽子、莪術(shù)等中藥抗雌激素及ER的報(bào)道，但已經(jīng)證實(shí)鴉膽子、莪術(shù)是非特異性促細(xì)胞凋亡的中藥[9-10]。本課題前期研究也經(jīng)病理學(xué)證實(shí)此藥方可使子宮內(nèi)膜組織發(fā)生崩解、脫落[11]。推測(cè)凋膜止崩液下調(diào)ER及亞型可能與其促使子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡，使ER及亞型遭到破壞有關(guān)，此推測(cè)尚待進(jìn)一步研究證實(shí)。

[1]孫維剛.子宮內(nèi)膜增生癥的命名、分類(lèi)及研究進(jìn)展[J].實(shí)用婦產(chǎn)科雜志，2007，23（11）：648-650．

[2]錢(qián)洪浪，朱依敏，周彩云，等.雌激素受體亞型ERα和ERβ在絕經(jīng)過(guò)渡期婦女子宮內(nèi)膜病變中的表達(dá)[J].中國(guó)實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志,2006，22(9):673-676.

[3]葉紅，楊菁，劉開(kāi)華，等.雌激素β受體在不孕癥患者子宮內(nèi)膜中的表達(dá)及調(diào)控[J].實(shí)用婦產(chǎn)科雜志,2004，20(1):44.

[4]Hu K，Zhong G,He F.Expression of estrogen receptors ER alpha and ER beta in endometrial hyperplasia and adenocarcinoma[J].Int J Gynecol Cancer,2005,15(3):537-541.

[5]王言奎，解其貴，羅兵.雌激素受體亞型在子宮內(nèi)膜增生中的表達(dá)[J].中國(guó)婦產(chǎn)科臨床雜志,2005，6(2):127-130.

[6]覃建慶，宋一麗，李明勛.雌孕激素受體在子宮內(nèi)膜癌、子宮內(nèi)膜不典型增生及正常子宮內(nèi)膜中不同表達(dá)的臨床意義[J].醫(yī)學(xué)研究雜志,2006，35(2):27-29.

[7]楊廣英，陳劉生，蔡春環(huán)，等.雌孕激素受體在圍絕經(jīng)期出血子宮內(nèi)膜病理分型與臨床治療中的表達(dá)[J].臨床醫(yī)學(xué),2004，24(4):66-67.

[8]Sivridis E,Giatromanolaki A.Endometrial adenocarcinoma:beliefs and scepticism[J].Int J Surg Pathol,2004,12(2):99-105.

[9]楊利輝，石文建，趙喜慶.鴉膽子抗腫瘤作用的研究進(jìn)展[J].牡丹江醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2010，31(5):65-66.

[10]王霞，徐立春.莪術(shù)醇抗腫瘤研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2009，15(22):3483-3485.

[11]賀豐杰，朱虹麗，李小寧.活血化瘀法靶向干預(yù)大鼠子宮內(nèi)膜增生癥的超微結(jié)構(gòu)研究[J].江蘇中醫(yī)藥,2011,43(5):90-92.

Effects of Diaomozhibeng Liquid on the Expression of ER，ERα and ERβ of Uteri Endometrial Tissue in Rats with Endometrial Hyperplasia

HE Fengjie,LI Xiaoning,ZHANG Qian,BAI Jun

Shaanxi University of Chinese Medicine,Xianyang 712046,China

Objective:To explore the role and the possible mechanism of Diaomozhibeng liquid in rats with the endome?trial hyperplasia(EH).Methods:Forty-eight SD rats were divided into four groups including control group,model control group,the experimental low-dose group and the experimental high-dose group.The rat model of endometrial hyperplasia was induced with estrogen load.The Diaomozhibeng liquid was administrated in uterine cavity in rats.The expression levels of es?trogen receptor(ER),ERα and ERβ were checked by immunohistochemistry.Results:Compared with control group,expres?sions of ER,ERα and ERβ increased in rats of the model group(P<0.001).However,after treatment with Diaomozhibeng liq?uid,the expression of ER,ERα and ERβ significantly decreased(P<0.001).Expression levels of ER,ERα and ERβ were significantly lower in high-dose experimental group than those of low-dose experimental group(P＜0.05 or P＜0.01).Con?clusion:Diaomozhibeng liquid plays a role in endometrial hyperplasia by accelerating the ecclasis of uterine endometrial.One of mechanisms is maybe related to inhibiting the expression of ER,ERα and ERβ.

functional uterine bleeding endometrial hyperplasia receptors,estrogen estrogen receptor alpha estro?gen receptor beta diaomozhibeng liquid

10.3969/j.issn.0253-9896.2012.08.013

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：30873354）；陜西省“13115”科技創(chuàng)新工程重大科技專(zhuān)項(xiàng)計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2008ZD?KG—81）

712046咸陽(yáng)，陜西中醫(yī)學(xué)院

（2011-12-30收稿 2012-03-12修回）

（本文編輯 閆娟）