姜忠敏 成元華王淑妍

黏附分子L1在胃腸道間質(zhì)瘤中的表達(dá)及其臨床意義

姜忠敏 成元華△王淑妍

目的：探討?zhàn)じ椒肿覮1在胃腸道間質(zhì)瘤（GIST）中的表達(dá)情況及其臨床意義。方法：采用免疫組織化學(xué)法和RT-PCR檢測66例GIST、10例平滑肌腫瘤、6例神經(jīng)鞘瘤及14例正常腸壁組織中L1的表達(dá)情況，并分析其臨床意義。結(jié)果：胃腸道間質(zhì)瘤中L1蛋白及mRNA的表達(dá)率分別為57.6%（38/66）和83.3%（30/36），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；L1在不同侵襲危險性GIST中的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），但在不同性別、年齡、腫瘤部位、組織學(xué)類型中的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。L1在GIST中的表達(dá)明顯高于其在平滑肌腫瘤及正常腸組織中的表達(dá)（P<0.01），與其在神經(jīng)鞘瘤中的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：L1表達(dá)在GIST發(fā)生發(fā)展過程中起促進(jìn)作用，L1可作為GIST的診斷和鑒別診斷指標(biāo)。

神經(jīng)細(xì)胞黏附分子L1胃腸腫瘤 免疫組織化學(xué) 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) 胃腸道間質(zhì)瘤

胃腸道間質(zhì)瘤（gastrointestinal stromal tumors，GIST）是一種特殊的間葉源性腫瘤，主要發(fā)生在胃腸道，也可發(fā)生在其他部位[1]。隨著靶向藥物的問世及其耐藥普遍現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，臨床醫(yī)生用藥前要根據(jù)腫瘤的生物學(xué)行為對患者進(jìn)行綜合評估。目前GIST生物學(xué)行為評估主要根據(jù)GIST腫瘤體積大小和核分裂象的多少，然而近來發(fā)現(xiàn)直徑很小的GIST也可能發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移。因此尋找敏感、特異的標(biāo)志物評估腫瘤的生物學(xué)行為顯得尤為重要。由黏附分子介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞彼此之間的黏附力減弱和腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)的黏附力增強是近年來關(guān)于侵襲機制研究的熱點，筆者對黏附分子L1在GIST中的表達(dá)情況進(jìn)行分析，探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集1995年1月—2008年1月貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科初診為胃腸道間葉源性腫瘤的蠟塊共82例及相應(yīng)正常腸切端14例，根據(jù)光鏡下組織形態(tài)學(xué)特點及CD117、CD34、平滑肌肌動蛋白（SMA）、結(jié)蛋白（Desmin）及S-100蛋白免疫組化染色結(jié)果確診GIST 66例、平滑肌腫瘤10例、神經(jīng)鞘瘤6例。所有患者均經(jīng)病理醫(yī)生復(fù)查。每個腫瘤HE染色均經(jīng)病理醫(yī)生評估以下特征：組織類型、壞死、核分裂象（在400倍放大下觀察50個視野）等。

1.2 主要試劑 鼠抗人單克隆L1抗體（Neomarker公司），Envision試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺（DAB）試劑盒（美國Dako公司），RT-PCR相關(guān)試劑（美國Promega公司）。光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司），ND-1000分光光度計（美國NanoDrop公司），低溫高速離心機（德國Heraeus公司），梯度PCR儀（美國Bio-Rad公司）。

1.3 方法

1.3.1 總RNA提取 采用Trizol試劑一步法提取石蠟包埋組織中總RNA，采用分光光度計檢測RNA溶液在280、260 nm波長下的光密度（OD），計算OD260/OD280的比值以驗證RNA的純度。

1.3.2 RT-PCR檢測 L1 mRNA擴增引物參考文獻(xiàn)[2]設(shè)計，由上海生工生物工程有限公司合成，上游引物5'-TT?GGGAGAAGAGAAGGGT-3'，下游引物 5'-TGAAGCAGAG?GATGAGCA-3'，擴增片段長度268 bp；以β-actin為內(nèi)參照，上游引物5'-TGGCACCACACCTTCTACAATGAGC-3'，下游引物5'-GCACAGCTTCTCCTTAATGTCACGC-3'，擴增片段長度396 bp。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系20 μL，擴增條件為94℃1 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，94 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共40個循環(huán)，然后72℃7 min做終延伸。取PCR產(chǎn)物5 μL，1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外線燈下觀察電泳條帶并進(jìn)行分析。位于268 bp和396 bp上的條帶分別為L1和β-actin mRNA的擴增片段，如在268 bp出現(xiàn)擴增片段則判斷L1 mRNA陽性表達(dá)，否則為陰性。

1.3.3 免疫組化染色 采用Envison兩步法：取上述存檔的石蠟組織塊，連續(xù)組織切片，厚4 μm，常規(guī)HE染色及免疫組化染色。免疫組化染色按試劑盒說明書操作。用已知陽性片和PBS代替一抗分別作為陽性和陰性對照。L1以胞膜及胞漿內(nèi)呈棕黃色細(xì)顆粒為陽性。由兩名病理醫(yī)師獨立觀察，選染色均勻腫瘤區(qū)10個高倍視野，以陽性細(xì)胞所占的百分比計分：無陽性細(xì)胞記0分；陽性細(xì)胞率<25%記1分；陽性細(xì)胞率26%~50%記2分；陽性細(xì)胞率＞51%記3分。

1.3.4 GIST生物學(xué)行為評價 按Fletcher等[3]推薦的GIST生物學(xué)行為評價表進(jìn)行分組，66例GIST可分為極低、低、中和高度侵襲危險性4組。1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用ANOVA單因素方差分析，組間多重比較采用q檢驗；計數(shù)資料采用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GIST中L1蛋白表達(dá)情況及與臨床病理特點之間的關(guān)系 隨著GIST侵襲危險性增加，L1表達(dá)率也明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。不同性別、年齡組、腫瘤部位和組織學(xué)類型間比較，L1表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05），見表1。

Table 1 The relationship between the expression of L1 and clinicopathologic features in GIST表1 GIST中L1表達(dá)情況與臨床病理特點的關(guān)系 例（%）

2.2 L1在GIST、平滑肌腫瘤、神經(jīng)鞘瘤及正常腸壁組織中的表達(dá) L1蛋白在GIST中的陽性表達(dá)率高于胃腸道平滑肌腫瘤及正常腸壁組織中的表達(dá)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），與其在神經(jīng)鞘瘤中的表達(dá)相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表2、圖1。

Table 2 The expression of L1 in GIST,smooth muscle tumor,schwannoma and the normal bowel tissue表2 L1在GIST、平滑肌腫瘤、神經(jīng)鞘瘤及正常腸壁組織中的表達(dá)情況 例（%）

2.3 石蠟包埋組織中RNA提取的結(jié)果 從66例石蠟包埋的GIST標(biāo)本中提取總RNA，其中40例提取成功。測定總RNA的OD260/OD280比值為1.67±0.17，RNA濃度為（1.58±0.75）mg/L。凝膠電泳明顯可見28 S、18 S及5 S核糖體RNA條帶，28 S與18 S比值接近于2，說明樣品RNA未完全被降解，見圖2。

2.4 GIST中L1 mRNA及蛋白的表達(dá)情況 40例GIST中只有36例擴增成功，其中L1 mRNA陽性表達(dá)率為83.3%（30/36），高于L1蛋白表達(dá)[57.6%（38/66）]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.955，P<0.01）。L1 mRNA在極低、低、中、高度侵襲危險性不同組中的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其中低度與中度組間L1 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），其余組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表3、圖3。

Table 3 The comparative analysis of L1 mRNA expression in different aggressive risk groups表3 L1 mRNA表達(dá)在不同侵襲危險性組間比較

3 討論

神經(jīng)細(xì)胞黏附分子L1（CD171）于20世紀(jì)80年代被發(fā)現(xiàn)具有促進(jìn)神經(jīng)再生作用，能介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞之間的黏附，在神經(jīng)軸突的生長、聚集，神經(jīng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，纖維髓鞘的形成，神經(jīng)通路的構(gòu)建及信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面具有非常重要的作用[4]。最初認(rèn)為，L1只表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)，后來研究發(fā)現(xiàn)其在多種不同來源的腫瘤如膀胱癌[4]、乳腺癌[5]、胰腺癌[6]、結(jié)直腸癌[7]等組織中過表達(dá)，且與腫瘤的浸潤、進(jìn)展及預(yù)后密切相關(guān)。因此，L1成為多種腫瘤診斷、鑒別診斷、生物學(xué)行為評估、預(yù)后判斷及靶向治療的有用指標(biāo)之一。Kaifi等[8]用免疫組化法首次檢測到L1在GIST中高表達(dá)，表達(dá)率為74%（53/72），但在胃腸道平滑肌腫瘤和纖維瘤病中不表達(dá)。Zander等[9]在GIST患者血液中檢測到L1，且可溶性L1濃度與患者的預(yù)后密切相關(guān)。但在國內(nèi)還少見相關(guān)報道。

本研究顯示GIST組織中L1蛋白表達(dá)陽性率為57.6%。RNA提取成功的GIST中L1 mRNA的表達(dá)率為83.3%，高于L1蛋白表達(dá)率，該差異的產(chǎn)生可能是由于：（1）L1與去整合素-金屬蛋白酶10（adis?integrin and metalloprotease,ADAM10）同時存在于腫瘤組織中，ADMA10能促使L1從腫瘤細(xì)胞膜上脫落，從而影響L1的檢出率[10]。（2）由于組織經(jīng)福爾馬林固定后，細(xì)胞表面蛋白發(fā)生交聯(lián)，結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，以致不能和相應(yīng)抗體結(jié)合。因此筆者認(rèn)為GIST中檢測L1 mRNA更敏感，有助于提高GIST診斷的準(zhǔn)確性。L1表達(dá)存在一定的特異性，在正常組織及最易與GIST混淆的胃腸道平滑肌腫瘤中均呈陰性表達(dá)，提示L1在GIST的診斷以及與消化道平滑肌源性腫瘤的鑒別中有重要參考價值。L1在不同侵襲危險性GIST組間的表達(dá)水平有明顯差異，隨侵襲危險性的升高，其表達(dá)陽性率和表達(dá)強度依次升高，此結(jié)果與Kaifi等[8]的研究結(jié)果相似，提示L1可以作為預(yù)測GIST生物學(xué)行為的參考指標(biāo)。

[1]Paral J,Slaninka I,Kalabova H,et al.Gastrointestinal stromal tu?mors:review on morphology,molecular pathology,diagnostics,prog?nosis and treatment options[J].Acta Gastroenterol Belg,2010,73(3):349-359.

[2]Laifenfeld D,Karry R,Klein E,et al.Alterations in cell adhesion mol?ecule L1 and functionally related genes in major depression:a post?mortem study[J].Biol Psychiatry,2005,57（7）：716-725.

[3]Fletcher CD,Beman JJ,Corless C,et al.Diagnosis of Gastrointestinal stromal tumors:a consensus approach[J].Hum Pathol,2002,33（5）:459-465.

[4]Jung J,Son YS,Park H,et al.The cell adhesion molecule L1 pro?motes gallbladder carcinoma progression in vitro and in vivo[J].On?col Rep,2011,25(4):945-952.

[5]Li Y,Galileo DS.Soluble L1CAM promotes breast cancer cell adhe?sion and migration in vitro,but not invasion[J].Cancer Cell Int,2010,10:34-39.

[6]Tsutsumi S,Morohashi S,Kudo Y,et al.L1 Cell adhesion molecule(L1CAM)expression at the cancer invasive front is a novel prognos?tic marker of pancreatic ductal adenocarcinoma[J].J Surg Oncol,2011,103(7):669-673.

[7]Kajiwara Y,Ueno H,Hashiguchi Y,et al.Expression of l1 cell ad?hesion molecule and morphologic features at the invasive front of colorectal cancer[J].Am J Clin Pathol,2011,136(1):138-144.

[8]Kaifi JT,Strelow A,Schurr PG,et al.L1(CD171)is highly ex?pressed in gastrointestinal stromal tumors[J].Mod Pathol，2006,19(3):399-406.

[9]Zander H,Rawnaq T,von Wedemeyer M,et al.Circulating levels of cell adhesion molecule L1 as a prognostic marker in gastrointesti?nal stromal tumor patients[J].BMC Cancer,2011,11(1):189-196.

[10]Gutwein P,Mechtersheimer S,Riedle S,et al.ADAM10-mediated cleavage of L1 adhesion molecule at the cell surface and in re?leased membrane vesicles[J].Faseb J,2003,17(2):292-294.

Expression and Clinical Significance of Adhesion Molecule L1 in Gastrointestinal Stromal Tumors

JIANG Zhongmin,CHENG Yuanhua,WANG Shuyan

Department of Pathology,Tianjin Fifth Central Hospital,Tianjin 300450,China

Objective:To investigate the expression of the adhesion molecule L1 in gastrointestinal stromal tumors(GIST),and the clinical significance thereof.Methods:The expression levels of L1 were detected in tissues of 66 samples of GIST,10 samples of smooth muscle tumors,6 samples of schwannoma and 14 samples of normal bowel by immunohistochem?istry and RT-PCR,and their clinical significances were analyzed.Results:The expression rates of L1 protein and mRNA in GIST were 57.6%(38/66)and 83.3%(30/36),which were significantly different between two groups(P<0.05).The L1 expres?sion was significantly different in the different aggressive risk of GIST(P<0.05),but there was no significant difference in dif?ferent age,gender,tumor locus and tissue type groups(P>0.05).The expression of L1 was significantly higher in GIST than that of smooth muscle tumor and normal bowel tissues(P<0.01).There was no significant difference in the expression of L1 between GIST group and schwannoma groupss(P>0.05).Conclusion:The expression of L1 may play an important role in tu?morigenesis and progression of GIST,which suggest that L1 can be applied to diagnosis or differential diagnosis of GIST.

neural cell adhesion molecule L1 gastrointestinal neoplasmsimmunohistochemistryreverse transcrip?tase polymerase chain reaction gastrointestinal stromal tumors

10.3969/j.issn.0253-9896.2012.08.010

300450天津市第五中心醫(yī)院病理科（姜忠敏）;貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科（成元華,王淑妍）

△通訊作者 E-mail：chengyuanhua@163.com

（2011-07-19收稿 2012-02-07修回）

（本文編輯 李鵬）