周 歷，馬德順，楊 毓，高淑云

（沈陽(yáng)大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng)110044）

Pinch－3蛋白對(duì)細(xì)胞形態(tài)及牽引力的影響

周 歷，馬德順，楊 毓，高淑云

（沈陽(yáng)大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng)110044）

用基因敲除的方法比較了正常腎小球足細(xì)胞和Pinch－3蛋白缺失細(xì)胞的形態(tài)差異和牽引力的差異，發(fā)現(xiàn)當(dāng)Pinch－3蛋白缺失后，細(xì)胞表面出現(xiàn)了許多孔隙，同時(shí)細(xì)胞投影面積平均增加40%；細(xì)胞的牽引力則平均減小40%左右，這說(shuō)明當(dāng)腎小球足細(xì)胞的Pinch－3基因的表達(dá)受到抑制以后，細(xì)胞膜上產(chǎn)生的孔隙使細(xì)胞膜變得松散，進(jìn)而使得表面積增大.細(xì)胞牽引力減小40%，說(shuō)明細(xì)胞膜上的孔隙對(duì)細(xì)胞牽引力的形成具有較強(qiáng)的影響.

Pinch－3；腎小球足細(xì)胞；基因敲除；細(xì)胞形態(tài)；影響

細(xì)胞形態(tài)和牽引力是細(xì)胞的重要物理性質(zhì)，它與細(xì)胞的許多生物過(guò)程有著密切的關(guān)系，比如炎癥反應(yīng)、創(chuàng)傷修復(fù)、血管生成、形態(tài)保持、信號(hào)傳導(dǎo)以及新陳代謝等［1］.細(xì)胞牽引力由肌動(dòng)球蛋白的相互作用和肌動(dòng)蛋白的聚合作用而產(chǎn)生［2－4］，受平滑肌肌動(dòng)蛋白 （α－SMA）的調(diào)節(jié)［5－6］.不同的細(xì)胞其牽引力不同，相同的細(xì)胞在不同的發(fā)育階段其牽引力也不一樣［7－9］，例如前交叉韌帶干細(xì)胞經(jīng)過(guò)一周的分化，其牽引力將減小30%左右［9］.目前，關(guān)于細(xì)胞牽引力的研究還很有限，國(guó)內(nèi)只有北京大學(xué)、北京理工大學(xué)和沈陽(yáng)大學(xué)報(bào)道過(guò)該領(lǐng)域的研究成果［10］.Pinch－3蛋白對(duì)細(xì)胞的形態(tài)保持有著重要作用，它與整合素形成信號(hào)復(fù)合物，參與細(xì)胞的勃著勃附作用，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的形態(tài)［11］.為了觀察Pinch－3蛋白對(duì)細(xì)胞形態(tài)和牽引力的影響，本研究用基因敲除的辦法使Pinch－3基因沉默，用CTFM法測(cè)定了腎小球足細(xì)胞在基因敲除前后細(xì)胞牽引力的變化，觀察和比較了細(xì)胞的形態(tài)變化，試圖發(fā)現(xiàn)Pinch－3蛋白對(duì)腎小球足細(xì)胞的物理性質(zhì)的影響.

1 材料與方法

1.1 人體組織及實(shí)驗(yàn)材料

人體組織腎小球足細(xì)胞由芝加哥大學(xué)附屬醫(yī)院提供，系28歲健康男性白人，死于車禍；轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基（sc－36868）、Pinch－3 sh RNA和cop GFP對(duì)照質(zhì)粒購(gòu)于美國(guó)百泰克公司，DMEM培養(yǎng)液，犢牛血清及所用實(shí)驗(yàn)材料購(gòu)于西格瑪公司.

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將人體組織腎臟解剖并分離出腎小球足細(xì)胞置于培養(yǎng)皿中，充分剪碎、消化和吹打后，將組織懸液以1 000 r／min離心5 min去上清，加入培養(yǎng)液吹打，然后接種于100 m L培養(yǎng)瓶中，加入不含抗生素的DMEM培養(yǎng)液，內(nèi)含20%犢牛血清，置CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，5%CO2，37℃培養(yǎng).培養(yǎng)1 d換液，去除未貼壁的細(xì)胞.用倒置顯微鏡（尼康TE－2000）觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài).3 d后取出并用sh RNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基（sc－36868）漂洗一次，吸去培養(yǎng)基并迅速進(jìn)行轉(zhuǎn)染.

1.3 基因敲除

將Pinch－3 shRNA和cop GFP對(duì)照質(zhì)粒加入轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中，濃度為1 000 ng／μL，小心均勻地覆蓋在漂洗過(guò)的細(xì)胞上，培養(yǎng)過(guò)夜，對(duì)照組只用cop GFP對(duì)照質(zhì)粒處理，次日將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞移植在測(cè)試細(xì)胞牽引力的彈性基質(zhì)上，6 h后用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察挑選轉(zhuǎn)染陽(yáng)性和陰性對(duì)照分別進(jìn)行形態(tài)觀察和牽引力測(cè)算.

1.4 細(xì)胞牽引力測(cè)算

采用 CTFM（Cell Traction Force Microscopy）技術(shù)，即顯微鏡追蹤法測(cè)定細(xì)胞牽引力技術(shù).這是一種根據(jù)細(xì)胞基質(zhì)彈性表面形變來(lái)測(cè)算細(xì)胞牽引力的技術(shù).在制備彈性基質(zhì)時(shí)摻入熒光微珠，當(dāng)細(xì)胞貼附后會(huì)使基質(zhì)產(chǎn)生形變，當(dāng)細(xì)胞脫離時(shí)再回復(fù)原位，這種基質(zhì)的形態(tài)變化可以通過(guò)熒光微珠的位移表現(xiàn)出來(lái)，可以用熒光顯微鏡追蹤觀察.將細(xì)胞脫離前后的基質(zhì)形態(tài)變化拍成圖片，用MATLAB 7.0運(yùn)行專用自編程序進(jìn)行比較分析即可測(cè)算出細(xì)胞牽引力.其過(guò)程主要分為3個(gè)步驟：①拍攝細(xì)胞圖片，以確定細(xì)胞牽引力的區(qū)域；②分別拍攝細(xì)胞貼附時(shí)和脫離后的基質(zhì)形態(tài)圖片，以確定熒光微珠的位移；③將拍攝的三張圖片上機(jī)分析.

2 結(jié) 果

腎小球足細(xì)胞轉(zhuǎn)染以后，形態(tài)上有了明顯的變化，由于Pinch－3蛋白的缺失，在細(xì)胞膜表面形成了許多孔隙（圖1），同時(shí)表面積明顯增大（圖2）；細(xì)胞牽引力則明顯減小，平均減小40%左右（圖3）；這與細(xì)胞表面積增大的結(jié)果是吻合的.

圖1 基因敲除前后腎小球足細(xì)胞形態(tài)對(duì)比Fig.1 The comparison of cell morphology of podoeyte cells before and after knockout

圖2 基因敲除前后腎小球足細(xì)胞表面積比較Fig.2 The comparison of projected area of podocyte cells before and after knockout

圖3 基因敲除前后腎小球足細(xì)胞牽引力比較Fig.3 The comparison of cell traction force of podocyte cells before and after knockout

3 討 論

Pinch－3蛋白對(duì)維持細(xì)胞形態(tài)具有重要作用，當(dāng)Pinch－3基因的表達(dá)受到抑制，導(dǎo)致細(xì)胞膜的一些成分缺失，進(jìn)而在膜上形成了許多孔隙；同時(shí)由于孔隙的增多，使膜的結(jié)構(gòu)變得松散，導(dǎo)致細(xì)胞的表面積增大.

細(xì)胞牽引力減小的原因應(yīng)該歸結(jié)于細(xì)胞表面積的增大，因?yàn)榧?xì)胞牽引力與細(xì)胞的投影面積成反比，表面積增大40%，在產(chǎn)生牽引力的其他因子不變的條件下?tīng)恳p少40%，與細(xì)胞投影面積增加的結(jié)果是一致的.這說(shuō)明Pinch－3蛋白除了影響細(xì)胞膜的組成外，還通過(guò)影響細(xì)胞表面積間接影響細(xì)胞的牽引力.

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Effect of Pinch－3 Protein in Podocytes on Cell Morphology and Cell Traction Force

ZHOULi，MADeshun，YANGYu，GAOShuyun
（College of Biological and Environmental Engineering，Shenyang University，Shenyang 110044，China）

The change of morphology of podocytes was compared and the difference of cell traction force of podocytes was measured before and after knockout Pinch－3 DNA in this experiment.It was found that a number of pores appeared on the cells surface and the cells projected area increased by average of 40%after gene knockout，but the cell traction force of podocyte were significantly reduced by average of 40%.This suggests that when the expression of the podocytes Pinch－3 gene is inhibited，some pores will appear on the cells surface，and these pores make the membrane of the cells become laxer，and then the cells projected area become larger.The cell traction force decrease correspondingly by average of 40%，which suggests that the pores on the cell surface strongly affect the cell traction force.

Pinch－3；podocyte；knockout；cell morphology；effect

Q 28

A

1008－9225（2012）01－0045－03

2011－03－25

沈陽(yáng)市引智計(jì)劃資助項(xiàng)目（D20102101006）.

周 歷（1986－），女，遼寧營(yíng)口人，沈陽(yáng)大學(xué)碩士研究生；馬德順（1962－），男（回族），遼寧沈陽(yáng)人，沈陽(yáng)大學(xué)教授，博士.

李 艷】