肖鉀鈣鎂，王素英，魏文進，張靜飛，林福玉

（1.北京民海生物科技有限公司研發(fā)中心 結合疫苗北京市重點實驗室，北京 102600；

2.天津商業(yè)大學 生物技術與食品科學學院，天津 300134）

白喉毒素突變體CRM197原核表達載體構建及其蛋白表達

肖鉀鈣鎂1，2，王素英2，魏文進1，張靜飛1，林福玉1

（1.北京民海生物科技有限公司研發(fā)中心 結合疫苗北京市重點實驗室，北京 102600；

2.天津商業(yè)大學 生物技術與食品科學學院，天津 300134）

將合成的CRM197基因片段克隆到表達載體pBAD－DEST49中，轉化到大腸桿菌菌株（ATCCMC1061）.經阿拉伯糖誘導，CRM197獲得高效表達.目的蛋白主要以包涵體形式存在，變性、復性后經DEAE陰離子交換后獲得高于95%純度的CRM197樣品.用該樣品做Western blotting鑒定后，能得到單一的特異性條帶.本實驗的表達策略，為CRM197進一步生產及應用奠定基礎.

CRM197；白喉毒素；大腸桿菌

白喉毒素（Diphtheria Toxin，DT）是由感染β噬菌體基因組的白喉棒狀桿菌所產生的外毒素.白喉毒素經過甲醛脫毒處理后可以制成白喉類毒素，用作疫苗載體蛋白，但要獲得白喉類毒素必須經過大體積毒性物質處理，這一處理過程可能恢復白喉毒素的毒性.使用無毒的白喉毒素突變體可以避免上述問題［1－2］.

目前用的最多的是白喉變異毒素CRM197（cross reacting material 197，CRM197）［3］.CRM197是白喉毒素的一種突變體，由白喉毒素的編碼基因發(fā)生G→A單堿基突變，導致編碼產物的第52位氨基酸殘基由谷氨酸殘基取代了甘氨酸殘基，致使白喉毒素酶活性位點發(fā)生改變，喪失其酶活性后制得，它已不能對細胞產生毒性作用.但CRM197仍保留了白喉毒素的免疫原性，在抗原性和免疫原性上與天然的白喉毒素相似.CRM197作為載體已成功地用于b型流感嗜血桿菌，肺炎鏈球菌，腦膜炎雙球菌結合疫苗，在動物及人體上均顯示出良好的安全性和免疫原性.

該研究采用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達CRM197蛋白，進而建立一種廉價、高效、安全的CRM197表達體系.

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌菌株（ATCC－MC1061）和載體pBAD－DEST49均為北京民海生物科技有限公司實驗室保存.

DNA相對分子質量標準和各種限制性內切酶均購自TAKARA；T4DNA連接酶購自NEB；膠回收試劑盒和質粒小量提取試劑盒均購自中科瑞泰；蛋白質Marker購自北京全式金生物技術有限公司；Sepharose Fast Flow購自GE Healthcare；HRP標記的兔抗馬IgG購自北京博奧森生物有限公司；白喉絮狀反應抗毒素國家標準品（400Lf）由北京民海生物科技有限公司實驗室提供，批號20100201.CRM197陽性對照（28mg／mL）.

1.2 實驗方法

1.2.1 目的基因的設計和合成

根據GenBank中白喉毒素的基因序列（登錄號：CQ967258），進行密碼子優(yōu)化.合成基因：將其中第155位核苷酸由g變?yōu)閍.然后在合成基因的5’端加入BglⅡ酶切位點，并在位點后添加信號肽OMPA基因序列［4－5］，3’端應用終止密碼子taa并在其后加入XhoⅠ酶切位點.合成實驗由上海捷瑞生物工程有限公司完成.

1.2.2 重組質粒的構建

BglⅡ／XhoⅠ雙酶切合成的CRM197基因片段，與經過同樣酶處理的pBAD－DEST49載體連接，篩選克隆鑒定獲得表達載體pBAD－DEST49／CRM197.篩選陽性克隆.進行酶切鑒定.

1.2.3 CRM197的誘導表達

將pBAD－DEST49／CRM197轉入大腸桿菌表達宿主中，挑取轉化子過夜培養(yǎng)，然后按1∶100（質量分數）的比例轉接于質量分數0.1%氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基中，37℃、180r／min搖床培養(yǎng)至OD600為0.6時，按1∶100（質量比數）的比例加入終濃度為質量分數20%的阿拉伯糖誘導表達5h.將培養(yǎng)液10 000r／min離心，分離上清和沉淀.沉淀超聲破碎后，離心分別收集上清和沉淀.SDS－PAGE檢測表達蛋白是以可溶性還是以包涵體形式存在［6－7］.

1.2.4 CRM197的純化

對以可溶性形式表達的目的蛋白純化時，收集離心后的上清，過DEAE陰離子柱，用梯度洗脫法洗脫，純化目的蛋白.對以包涵體形式表達目的蛋白純化時，收集離心后的沉淀，用8mol／L尿素的裂解液溶解，然后用TE復性，超濾濃縮后過DEAE陰離子柱，純化目的蛋白［8－9］.

1.2.5 CRM197的鑒定

將純化后的CRM197和陽性對照樣品經SDSPAGE后，用電轉儀轉移至PVDF膜，以白喉抗毒素（馬血清）為一抗，HRP標記的兔抗馬IgG為二抗，進行 Western blotting檢測.

2 結果與分析

2.1 pBAD－DEST49／CRM197質粒的鑒定

將重組表達質粒pBAD－DEST49／CRM197，經BglⅡ／XhoⅠ雙酶切鑒定后，用質量分數0.8%的瓊脂糖電泳顯示，該重組質粒酶切后產生一條約為1 700bp的條帶（見圖1），與設計后的CRM197基因片段大小一致.

圖1 重組表達載體pBAD－DEST49／CRM197酶切鑒定分析Fig.1 Identification of pBAD－DEST49／CRM197recombinant plasim

2.2 CRM197的表達

經SDS－PAGE分析，菌體上清中無目標蛋白，而離心后的菌體中有大量誘導蛋白.故重組CRM197主要以包涵體的形式表達，表達蛋白的相對分子質量約為6.0×104（生物學常表示為60kD，下同），見圖2.

2.3 CRM197的純化及鑒定

純化產物經SDS－PAGE及凝膠掃描分析，純度達95%以上.Western blotting檢測結果顯示，在相對分子質量為6.0×104處產生一條特異性條帶（見圖3）.

3 討論

目前，國外已經成功研制了利用無毒的CRM197作為載體制備小兒肺炎疫苗.但是，由于CRM197的產量比白喉毒素低得多，所以嚴重制約了疫苗的制備.

圖2 表達蛋白的SDS－PAGE分析Fig.2 Expression of recombinant protein analyzed by SDS－PAGE

圖3 純化產物的SDS－PAGE與 Western blotting分析Fig.3 SDS－PAGE results and Western blot analysis of purified CRM197

因大腸桿菌具有遺傳性狀了解透徹﹑生長快﹑培養(yǎng)經濟﹑表達水平高﹑待選質粒和宿主多等特點，在基因工程技術領域已成為首選的表達系統(tǒng)［10］.該研究利用基因重組技術，在大腸桿菌中表達蛋白CRM197.外源蛋白在宿主菌，如大腸桿菌中的表達形式多為細胞內不溶性表達（包涵體），少數為細胞外分泌表達.利用信號肽來引導外源蛋白定位分泌到細胞特定區(qū)間，提高可溶性，可避免因包涵體復性帶來的困難.目前研究采用的信號肽來自表達系統(tǒng)自身的信號序列或外源信號序列，或兩者兼而有之.研究表明，多種外源基因連接上信號肽后，在原核表達系統(tǒng)，如大腸桿菌、L型細菌、芽孢桿菌和乳酸桿菌中等都得到了分泌表達.故該實驗室在構建CRM197時，在其5’端連接了具有高分泌功能的分泌型信號肽OMPA.但由于CRM197蛋白太大，相對分子質量約為6.0×104，所以重組蛋白部分分泌到細胞間隙中，其余的主要以包涵體的形式表達.在對包涵體經過一系列變性復性后，過陰離子柱純化，能獲得達到95%以上純度的蛋白.以后的研究需要加強分泌表達的量和分泌蛋白的純化工作，還要對包涵體復性的方法進行比較和優(yōu)化.

利用該研究的表達體系進行大規(guī)模工業(yè)化生產，能解決CRM197產量不足的問題，促進以它為載體的疫苗研究和生產.

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Expression of diphtheria toxin mutantCRM197by construction of prokaryotic vector in Escherichia coli

XIAOJia－gai－mei1，2，WANGSu－ying2，WEIWen－jin1，ZHANGJing－fei1，LINFu－yu1
（1.Beijing Key Laboratory of Conjugate Vaccine，Beijing Minhai Biological Science and Technology Co.Ltd，Beijing 102600，China；
2.College of Biotechnology and Food Science，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134，China）

The gene ofCRM197（cross reacting material 197，CRM197）is synthesized and then expressed in Escherichia coli（ATCCMC1061）driven by pBAD－DEST49.CRM197is efficiently expressed by Arabinose induced.The recombinant protein is expressed mainly as inclusion body.After denaturation，renaturation and purification by DEAE anion－exchange column，CRM197with the purity higher than 95%is obtained.For Western blotting，the protein can get single specific bands.Given these characteristics，the CRM197expressed in Escherichia coli is suitable for further research.

CRM197；diphtheria toxin；Escherichia coli

Q786

A

1671－1114（2012）03－0078－03

2012－02－03

肖鉀鈣鎂（1984—），女，碩士.

林福玉（1972—），男，副研究員，主要從事基因工程方面的研究.

（責任編校 紀翠榮）