李 娜，牛瑞芳，韓瑞發(fā)，孫二琳

（1.天津醫(yī)科大學(xué) 腫瘤醫(yī)院，天津 300060；2.天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 天津泌尿外科研究所，天津 300211）

重組人干擾素α－2b－卡介苗（hIFN－α－2b－BCG）藥物敏感性分析

李 娜1，牛瑞芳1，韓瑞發(fā)2，孫二琳2

（1.天津醫(yī)科大學(xué) 腫瘤醫(yī)院，天津 300060；2.天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 天津泌尿外科研究所，天津 300211）

通過BACTEC MGITTM 960全自動(dòng)分枝桿菌培養(yǎng)鑒定／藥敏儀對重組人干擾素α－2b－卡介苗（hIFN－α－2b－BCG）菌株進(jìn)行利福平等10種抗菌藥物的敏感性試驗(yàn)，以野生BCG作對照觀察藥物對重組BCG菌株活性的潛在影響.結(jié)果發(fā)現(xiàn)：重組人干擾素α－2b－卡介苗在系統(tǒng)感染上對喹酮類的氧氟沙星、環(huán)丙沙星敏感，對氨基糖苷類藥物的慶大霉素和卡那霉素耐藥.在抗結(jié)核類藥物中，除對吡嗪酰胺耐藥外，對利福平等其他幾種抗生素均敏感.因尿液回收率高，幾乎所有的抗菌藥物都對膀胱中的菌株有影響.

膀胱腫瘤；重組BCG；人干擾素α－2b；免疫反應(yīng)；耐藥性

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，非肌層浸潤性腫瘤占75%，其中95%為高危尿路上皮癌，單純手術(shù)切除的近期復(fù)發(fā)率為60%～90%，遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)率近100%.野生型卡介苗（BCG）膀胱腔內(nèi)灌注是膀胱腫瘤最有效的生物治療方法之一.近年來，干擾素α（IFN－α）作為二線藥物用于膀胱灌注治療腫瘤，對部分BCG無反應(yīng)的患者有效，且局部和全身毒性小.但作者在BCG膀胱灌注治療中發(fā)現(xiàn)，病人治療中可出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥，也可引起威脅生命的BCG播散感染，即BCG炎癥或BCG病.病例分析表明BCG感染的并發(fā)癥主要有以下2種：（1）局部并發(fā)癥：BCG引起的類似膀胱炎癥的局部反應(yīng)，如尿急、尿頻、尿痛、血尿等.原因：BCG是一種監(jiān)督活疫苗，灌注膀胱后引起膀胱黏膜局部炎癥及暫時(shí)性的全身感染.（2）全身并發(fā)癥：BCG進(jìn)入血液循環(huán)引起全身并發(fā)癥，如高熱、肉芽腫樣改變、膿毒血癥、肺炎等.原因：膀胱腫瘤瘤體切除后，其黏膜下層及肌層很快形成血管豐富的肉芽組織，在黏膜尚未修復(fù)前，BCG容易通過這些肉芽腫組織進(jìn)入血液循環(huán)而致一系列全身反應(yīng).臨床常使用一些抗菌藥物來減輕并治療該副作用.由于抗生素使用的廣泛性，它們是否可以治療患者膀胱灌注后的不良反應(yīng)并影響B(tài)CG的活性，從而影響其抑制膀胱腫瘤的效果還有待探討.這些問題成為本研究的主旨.

多年臨床觀察和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)：BCG菌株的活性是抑制膀胱腫瘤復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素.隨著BCG抗腫瘤作用機(jī)制的深入研究，有學(xué)者認(rèn)為BCG是治療膀胱腫瘤最為有效的免疫制劑，明顯優(yōu)于化學(xué)療法.近來臨床上出現(xiàn)了多種聯(lián)合免疫治療方法，其中BCG聯(lián)合INF－α－2b被認(rèn)為是最行之有效的治療手段［1］.劉春雨等［2］先期采用現(xiàn)代基因工程技 術(shù) 構(gòu) 建 了 重 組 人IFN－α－2b－BCG （hIFN－α－2b－BCG），將其用于淺表性膀胱腫瘤復(fù)發(fā)的預(yù)防和免疫治療.重組BCG作為一種減毒的結(jié)核桿菌，被灌入膀胱后可引起炎癥反應(yīng)并釋放細(xì)胞因子，通過免疫反應(yīng)破壞腫瘤細(xì)胞并防止腫瘤復(fù)發(fā)，因此BCG治療的關(guān)鍵在于其菌株的活性［3－5］.

孫二 琳 等［6－7］對 重組 hIFN－α－2B－BCG 的 生 物學(xué)特性和小鼠原位膀胱腫瘤免疫效應(yīng)進(jìn)行了研究.本研究以野生BCG菌株作對照，進(jìn)行重組IFN－α－2b－BCG的藥敏試驗(yàn)，以探討某些抗菌藥物在有效減輕重組BCG灌注副作用的同時(shí)對重組IFN－2b－BCG活性的影響.

1 材料和方法

1.1 材料

2株丹麥野生型BCG購自北京生物制品研究所；2株重組hlFN－α－2b－BCG為天津泌尿外科研究所構(gòu)建并保存；Middlebrook 7H9購自美國sigma公司；BACTEC MGIT TM 960全自動(dòng)分枝桿菌培養(yǎng)、鑒定／藥敏儀為美國JOHSTON實(shí)驗(yàn)公司儀器；藥敏實(shí)驗(yàn)藥品利福平、異煙肼乙胺丁醇、對氨基水楊酸鈉、丁胺卡那、卡那霉素、鏈霉素、慶大霉素、氧氟沙星、環(huán)丙沙星等10種藥物均購自天津藥物研究所.

1.2 方法

1.2.1 野生BCG和重組hlFN－α－2b－BCG的培養(yǎng)

將2種BCG菌株接種于Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)基中，37℃搖床中震蕩培養(yǎng)，細(xì)菌進(jìn)入對數(shù)生長期后用培養(yǎng)液調(diào)整其濃度為1g／L.進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn).

1.2.2 藥敏實(shí)驗(yàn)藥品制備

由蒸餾水或DMSO稀釋藥物至500、250、100、10、4、2、0.5、0.25、0.1ug／mL，以獲得精確的MIC.

1.2.3 抗菌素敏感性檢測

使用BACTEC MGIT TM 960系統(tǒng)檢測方法.將Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)基中的菌株接種于BACTEC MGIT TM 960系統(tǒng)內(nèi)已加藥的快速培養(yǎng)管中.37℃培養(yǎng)1周.BACTEC MGIT TM 960全自動(dòng)分枝桿菌培養(yǎng)鑒定／藥敏儀系統(tǒng)采用連續(xù)熒光檢測技術(shù)，配套使用MGIT快速培養(yǎng)管，底部包埋有熒光顯示劑，直接感應(yīng)培養(yǎng)管內(nèi)氧氣濃度.當(dāng)培養(yǎng)管內(nèi)有分枝桿菌生長時(shí)，氧氣被消耗，熒光顯示劑在特定光源的激發(fā)下發(fā)生熒光，BACTEC MGIT熒光強(qiáng)度記憶探測器每隔60min連續(xù)測定培養(yǎng)管內(nèi)熒光強(qiáng)度，并通過數(shù)據(jù)處理得出陽性結(jié)果，以生長單位（GU，Growth Unit）形式報(bào)告.

2 結(jié)果與討論

本研究中檢測了對結(jié)核桿菌有抑制或殺滅作用的10種藥物，分屬于經(jīng)典抗結(jié)核類、氨基糖苷類和氟喹諾酮類3類藥物，其對重組hIFN－α－2b－BCG（以下簡稱重組BCG）和野生BCG的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1.當(dāng)藥物的最小抑菌濃度不超過標(biāo)準(zhǔn)劑量血藥質(zhì)量濃度的25%時(shí)，假設(shè)2種BCG菌株系統(tǒng)敏感；當(dāng)藥物的最小抑菌濃度低于尿藥質(zhì)量濃度的25%時(shí)，假設(shè)2種BCG菌株局部敏感.

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，重組BCG對喹酮類的氧氟沙星、環(huán)丙沙星敏感，對氨基糖苷類藥物的慶大霉素和卡那霉素耐藥；在抗結(jié)核類藥物中，除對吡嗪酰胺耐藥外，對利福平等其他幾種抗生素均敏感；而作為對照的野生BCG除對吡嗪酰胺耐藥、對慶大霉素系統(tǒng)耐藥外，對其他8種藥物均敏感.

有研究表明：短期使用異煙肼（INF）不會(huì)降低免疫治療的療效，長期使用會(huì)降低重組BCG抗腫瘤的作用［6］.

表1 重組BCG和野生BCG藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of recombinant hIFN－α－2bBCG susceptibility testing，control with wild BCG

作者試圖減少抗菌藥物對BCG的影響.在系統(tǒng)感染中，BCG的敏感性是由血藥濃度決定的.從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，一些抗菌藥物在血藥水平上影響B(tài)CG的活性.氨基糖甙類藥物中，血藥濃度上除慶大霉素、卡那霉素對重組BCG影響較小外，丁胺卡那、鏈霉素均對重組BCG活性有影響.在局部感染中，BCG對藥物的敏感性由尿藥濃度決定.由于被測藥物的MIC很少能達(dá)到最大尿藥濃度的25%，所以重組和野生BCG對除吡嗪酰胺外的9種藥物均敏感，9種藥物均可影響重組和野生BCG活性.

在眾多抗菌藥物中，氟喹諾酮類藥物有很好的耐受性，抗菌范圍較寬并可迅速被組織吸收.如果灌注治療過程早期出現(xiàn)如持續(xù)發(fā)熱或附睪炎等，使用非特異性的抗生素類藥物，如氟喹諾酮類，可有效減少并發(fā)癥的發(fā)生.少數(shù)情況下，如果患者對這種非特異性的藥物治療不敏感，應(yīng)考慮3種藥物（異煙肼，乙胺丁醇和利福平）聯(lián)合使用，同時(shí)使用類固醇控制過敏反應(yīng)［8］，但不排除聯(lián)合使用該類藥物可能會(huì)使BCG抗腫瘤作用喪失［9］.因此，在重組BCG對患者沒有造成嚴(yán)重影響的情況下，建議使用不影響B(tài)CG活性的藥物，臨床治療時(shí)可依據(jù)病人的實(shí)際情況，合理使用有效的藥物.

［1］ LAM J S，BENSON M C，O'DONNELL M A，et al.Bacillus CALMETE－Guerin plus interferon－alpha 2Bintravesical thera－py maintain an extended treatment plan for superficial bladder cancer with minimal toxicity［J］.Urol Oncol，2003，21（5）：354－360.

［2］ 劉春雨，韓瑞發(fā).PhlFN－α－2B穿梭質(zhì)粒在卡介苗中的表達(dá)［J］.中華泌尿外科雜志，2006，27：12－15.

［3］ BARTLETT G L，KREIDER J W，PURNELL D M，et al.Augmentation of immunity to line 10hepatoma by BCG：Comparison of different BCG preparations［J］.Cancer，1980，46：488－496.

［4］ AKAZA H，IWASAKI A，OHTANI M，et al.Expression of antitumor response：Role of attachment and viability of bacillus Calmette－Guérin to bladder cancer cells［J］.Cancer，1993，72：558－563.

［5］ BROSMAN S A.Bacillus Calmette－Guérin immunotherapy：Techniques and results［J］.Urol Clin N Am，1992，19：557－564.

［6］ 孫二琳，范曉東，王玉葉，等.重組hIFN－α－2B－BCG的生物學(xué)特性的觀察［J］.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2010，30（1）：46－50.

［7］ 孫二琳，范曉東，王玉葉，等.重組hIFN－α－2b－BCG對小鼠原位膀胱腫瘤免疫效應(yīng)的研究［J］.中華泌尿外科雜志，2011，32（01）：38－41.

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Analysis on drug sensitivity tests of recombinant hIFN－α－2bBCG

LINa1，NIURui－fang1，HANRui－fa2，SUNEr－lin2
（1.Tumour Hosptial of Tianjin Medical University，Tianjin 300060，China；
2.Tianjin Institute of Urological Surgery，The Second Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin 300211，China）

To understand the situation of drug resistance of hIFN－α－2bBCG，in order to explore the curative effects of antibiotics on adverse reaction caused by IFN－α－2b－BCG during treating bladder carcinoma and their impact on anti－tumor effect of recombinant IFN－α－2b－BCG，wild BCG served as control，10kinds of antibacterial drugs including rifampicin，potentially effective against the IFN－α－2b－BCG，were measured in vitro by the BACTEC 960TB method，to observe the potential impact of antibiotics on the activity of recombinant BCG strains.The results showed that IFN－α－2b－BCG was susceptible to quinolones in systemic infections but resistant to some aminoglycosides.It was resistant to pyrazinamide but showed good susceptibility toward the other antituberculosis drugs tested.Most antibacterials may interfere with IFN－α－2b－BCG in the bladder because of high urinary recovery.

urinary bladder neoplasms；recombinant BCG vaccine；IFN－α－2b；immunotherapy；drugresistance

R759.2

A

1671－1114（2012）03－0075－03

2011－12－14

國家自然科學(xué)基金（30872587）；天津衛(wèi)生局重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（11KJ147）；天津市科技支撐計(jì)劃重大項(xiàng)目（07ZCKFSH03200）；國家科技部“十一五”重大專項(xiàng)新藥創(chuàng)建課題（2009ZX09103－699）

李 娜（1983—），女，初級檢驗(yàn)師，主要從事腫瘤分子免疫方面的研究.

牛瑞芳（1965—），女，教授，主要從事生化分子生物學(xué)方面的研究.

（責(zé)任編校 紀(jì)翠榮）