曹曉霞，董 仕

（1.天津渤海職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津 300402；2.天津師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；3.天津市細胞遺傳與分子調(diào)控重點實驗室，天津 300387）

4個群體西太公魚mtDNA D－1oop區(qū)段的限制性片段長度多態(tài)性分析

曹曉霞1，董 仕2，3

（1.天津渤海職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津 300402；2.天津師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；3.天津市細胞遺傳與分子調(diào)控重點實驗室，天津 300387）

應(yīng)用PCR技術(shù)對天津市于橋水庫、北京市密云水庫、日本北海道和日本青森縣4個群體共151尾西太公魚（Hypomesusnipponensis）的mtDNA D－loop區(qū)段進行擴增，得到長度約為1.8kbp的擴增片段.擴增出的DNA片段使用13種核酸內(nèi)切限制酶進行酶切，其中8種核酸內(nèi)切限制酶（AluⅠ、DraⅠ、HaeⅢ、HindⅢ、HinfⅠ、MboⅠ、TaqⅠ和XspⅠ）有酶切位點，5種核酸內(nèi)切限制酶（AluⅠ、HinfⅠ、MboⅠ、TaqⅠ和XspⅠ）個體間存在變異.不同酶切結(jié)果組合后，共得到28種單倍型，于橋水庫、密云水庫、北海道和青森西太公魚均以單倍型6為主，分別為36.36%、38.30%、43.33%和26.67%；于橋水庫、密云水庫、北海道及青森西太公魚單倍型多樣性指數(shù)（h）分別為0.817 1、0.814 1、0.779 3和0.882 8；核苷酸多樣性指數(shù)（π）分別為0.007 918、0.007 326、0.007 255和0.009 710.于橋水庫西太公魚與密云水庫西太公魚之間的Rogers遺傳距離最小，為0.149 9；于橋水庫西太公魚與日本青森西太公魚之間的Rogers遺傳距離最大，為0.221 5；日本北海道西太公魚與密云水庫西太公魚之間的遺傳距離為0.151 1，大于于橋水庫西太公魚與密云西太公魚之間的遺傳距離，但小于日本境內(nèi)北海道西太公魚與青森西太公魚之間的遺傳距離.

西太公魚；mtDNA D－loop；RFLP；遺傳結(jié)構(gòu)

西太公魚（Hypomesusnipponensis）隸屬于硬骨魚綱、鮭形目、胡瓜魚科、公魚屬，是北半球的小型經(jīng)濟魚類，主要分布于太平洋亞洲沿岸的俄羅斯遠東、日本、朝鮮和中國黑龍江、圖們江、鴨綠江.西太公魚對溫度適應(yīng)范圍廣，又是廣鹽性魚類，可在淡水、咸淡水或低鹽分的河口淺海生活，可淡水定居，也可海淡水洄游.由于它成熟早、繁殖力以及適應(yīng)性強，在天然水域小型魚類群落中，往往能成為優(yōu)勢種群［1］.西太公魚群體主要為一齡魚，每年春季產(chǎn)卵，產(chǎn)卵后大部分個體死亡，死亡的個體轉(zhuǎn)化為肉食性魚類的餌料.西太公魚不會對其它經(jīng)濟魚類構(gòu)成直接危害，其種群有抑制野雜魚的作用，具有良好的生態(tài)效益［2］.公魚漁業(yè)在中國有廣闊的發(fā)展前景，因此，有必要采用一些現(xiàn)代遺傳學(xué)方法分析西太公魚的遺傳結(jié)構(gòu)特征，為公魚資源的保護與利用提供基礎(chǔ)性資料.

線粒體DNA的限制性片段長度多態(tài)（RFLP）分析技術(shù)自20世紀80年代中期以來已廣泛應(yīng)用在魚類群體遺傳結(jié)構(gòu)及品種鑒定上.應(yīng)用PCR技術(shù)對mtDNA上進化速度最快的D－loop區(qū)段進行擴增［3］，擴增產(chǎn)物利用核酸內(nèi)切限制酶處理，得到的限制性片段長度多態(tài)（RFLP）或限制性內(nèi)切酶圖譜具有相對的穩(wěn)定性，能反映一定的變異，是從分子水平研究動物種群遺傳學(xué)和進化遺傳學(xué)的一種有效手段［4］.已有一些學(xué)者通過對mtDNA的D－loop區(qū)段的RFLP檢測技術(shù)分析了魚類群體內(nèi)及群體間的遺傳多樣性［5－7］.該研究應(yīng)用 mtDNA 的 PCRRFLP檢測技術(shù)對采自天津市于橋水庫、北京市密云水庫、日本北海道以及日本青森的西太公魚mtDNA D－loop片段進行了研究.

1 材料與方法

1.1 實驗魚

天津市于橋水庫、北京市密云水庫、日本北海道以及日本青森共4個群體西太公魚的采集日期、尾數(shù)、體長及體重見表1.

表1 西太公魚數(shù)量、體長和體重Tab.1 Number，body length and body weight of Hypomesusnipponensis

1.2 基因組DNA的提取

在鮮活狀態(tài)下，從每尾實驗魚體上剪取約1.0 cm×0.5cm大小的尾鰭鰭條，放入加有TNES－U－rea的離心管中，加入蛋白水解酶K，混勻后37℃過夜.用酚／氯仿抽提法提取DNA，加入TE緩沖液，4 ℃保存［8］.

1.3 mtDNA的 D－loop區(qū)段的擴增

使用位于mtDNA的D－loop區(qū)段兩側(cè)的引物進行每尾實驗魚的D－loop區(qū)段的擴增.所用引物為L15923［9］和 H1067［10］.PCR反應(yīng)體系為50μL，模板DNA 0.8μg，兩種引物各40pmol，dNTP 5 μL，緩沖液（10×）5μL，Taq DNA聚合酶4.0U，雙蒸水加至50μL.其中dNTP、緩沖液和Taq DNA聚合酶為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品.PCR擴增反應(yīng)在Biometra公司的T－GRADIENT Themoblock PCR儀上完成.擴增程序為94℃預(yù)變性1min；94℃變性1min，45℃退火1min，72℃延伸1.5min，30個循環(huán)；最后72℃充分延伸5 min.

1.4 內(nèi)切酶酶切及凝膠電泳

用13種核酸內(nèi)切限制酶（AluⅠ、DraⅠ、EcoRⅠ、HapⅡ、HaeⅢ、HindⅢ、HinfⅠ、MboⅠ、PstⅠ、PvuⅢ、TaqⅠ、XbaⅠ和XspⅠ，均購自寶生物工程（大連）有限公司）對擴增的4組西太公魚的mtDNA D－loop區(qū)段進行酶切，內(nèi)切酶及緩沖液用量參照廠家的說明書.酶切片段經(jīng)質(zhì)量分數(shù)為1.2%～2.0%的瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，在UVITEC凝膠成像分析儀下觀察照相.依據(jù)電泳時加入TIANGEN 200bp DNA ladder以及100bp的DNA ladder估算酶切片段的長度.

1.5 數(shù)據(jù)處理和分析

當一種內(nèi)切酶酶切、電泳后，用A、B、C等字母來命名不同個體間出現(xiàn)的不同的酶切類型.對每一個體的mtDNA D－loop區(qū)段有酶切位點的幾種酶的酶切類型組合后，構(gòu)成這個個體的單倍型（haplotype）［11］.

參照Nei等［12］的方法計算單倍型多樣性指數(shù)（h）.單倍型多樣性指數(shù)根據(jù)以下公式估算

式中：xi為第i種單倍型在群體中的頻率；n為樣品數(shù)；l為單倍型總數(shù).

利用所采用的內(nèi)切酶數(shù)目及獲得的單倍型資料建立單倍型文件，利用內(nèi)切酶酶切位點和識別序列資料建立內(nèi)切酶文件.應(yīng)用REAP（restriction enzyme analysis package）軟件中的GENERATE、D、DA程序處理上述2文件.估算群體內(nèi)的核苷酸多樣性指數(shù)（nucleotide diversity，π）［13，14，15］.根據(jù)單倍型在各群體間的頻率，計算出群體間的Rogers遺傳距離［5，16］，應(yīng)用PHYLIP（Version 3.67，華盛頓大學(xué)，1993）軟件包中的NEIGHBOUR程序和TREEVIEW構(gòu)建群體的UPGMA聚類圖.

2 結(jié)果

2.1 mtDNA D－loop區(qū)段的PCR擴增

分別以提取的4個群體共151尾西太公魚的DNA為模板進行mtDNA D－loop區(qū)段的擴增，均得到大小相同的擴增片段，約為1.8kbp（圖1）.

圖1 西太公魚mtDNA D－loop區(qū)段的擴增結(jié)果Fig.1 Amplified product of mtDNA D－loop region of Hypomesusnipponensis.

2.2 mtDNA D－loop區(qū)段的單酶酶切結(jié)果

對所擴增的mtDNA D－loop區(qū)段進行酶切的13種核酸內(nèi)切限制酶中，有酶切位點的8種（AluⅠ、DraⅠ、HindⅢ、HaeⅢ、XspⅠ、HinfⅠ、TaqⅠ和MboⅠ），個體間有變異的是MboⅠ、HinfⅠ、AluⅠ、TaqⅠ和XspⅠ.圖2顯示了5種個體間存在變異的核酸內(nèi)切限制酶對所有實驗魚酶切后的電泳結(jié)果.其中有變異的酶TaqⅠ在不同個體各有5種酶切類型，分別用A、B、C、D、E表示，HinfⅠ在不同的個體中有4種酶切類型，分別用A、B、C、D表示，MboⅠ和AluⅠ在不同的個體中有3種酶切類型，分別用A、B、C表示，XspⅠ在不同的個體中有2種酶切類型，分別用A、B表示.另外3種酶對所有實驗魚的不同個體雖有酶切位點，但沒有變異出現(xiàn)，即一種酶對所有個體的酶切結(jié)果均相同，在4個群體中全部個體均用A表示其酶切類型.

圖2 西太公魚5種限制酶的酶切電泳圖譜Fig.2 Electrophoresis patterns of fragment of D－loop digested by five restriction endonucleases in Hypomesusnipponensis

表2列出了8種酶的所有酶切出的限制性片段的類型和長度，有些限制酶切類型片斷總和小于1 800bp，可能是由于大小相同片斷的重疊或者是由于酶切片斷太小檢測不到的原因.不同酶切結(jié)果組合后，共得到28種單倍型（表3）.

表2 核酸內(nèi)切限制酶酶切片段長度類型Tab.2 Restriction fragment patterns in four populations of Hypomesusnipponensis

表3 mtDNA D－loop單倍型及其在4個群體內(nèi)的分布Tab.3 Numbers and frequencies of haplotypes of mtDNA D－loop in four populations of Hypomesusnipponensis

a命名單倍型時酶的順序為：AluⅠ、DraⅠ、HaeⅢ、HindⅢ、HinfⅠ、MboⅠ、TaqⅠ、XspⅠ.括號中的數(shù)值為分布頻率.

2.3 遺傳多樣性指數(shù)及UPGMA聚類圖

于橋水庫、密云水庫、日本北海道和日本青森西太公魚4個群體內(nèi)的單倍型多樣性指數(shù)和核苷酸多樣性指數(shù)見表4.群體間的Rogers遺傳距離見表5，Rogers遺傳距離的UPGMA聚類圖見圖3.

表4 西太公魚4個群體內(nèi)單倍型多樣性指數(shù)（h）和核苷酸多樣性指數(shù)（π）Tab.4 Haplotype diversity（h）and nucleotide diversity（π）within four populations of Hypomesusnipponensis

表5 西太公魚4個群體間的Rogers遺傳距離Tab.5 Rogers'genetic distance among four populations of Hypomesusnipponensis

圖3 Rogers遺傳距離的UPGMA聚類圖Fig.3 UPGMA phenogram for four populations of Hypomesusnipponensis

3 討論

3.1 西太公魚的遺傳多樣性

核苷酸多樣性指數(shù)（π）被定義為某群體內(nèi)一組DNA序列的單位位點的核苷酸差異或替代的平均數(shù).其值越小，群體的多態(tài)程度越低，它是衡量mtDNA多態(tài)程度的最有用的指標之一［15］.線粒體DNA的單倍型多樣性指數(shù)（h）同樣可以衡量群體內(nèi)的變異程度，它的含義類似于核DNA的雜合度，雖然mtDNA是母系遺傳，但其單倍型多樣性指數(shù)依然可以衡量被分析群體內(nèi)的遺傳變異［12］.mtDNA雖然進行自我復(fù)制，但它的功能在很大程度上受核基因組基因的控制，mtDNA復(fù)制、重組、轉(zhuǎn)錄等過程所需的酶都是由核基因編碼的［17］.

該研究結(jié)果得到，日本北海道西太公魚的π值以及h值最小，分別為0.007 255和0.779 3，日本青森西太公魚的π值最大，分別為0.009 710和0.882 8.在4個群體西太公魚中，日本青森西太公魚的遺傳多樣性較高，日本北海道西太公魚的遺傳多樣性較低.

3.2 中國西太公魚的來源

公魚是公魚屬魚類的統(tǒng)稱，是北半球的小型經(jīng)濟魚類.解玉浩［1］將公魚分為5個種和亞種：（1）池沼公魚H.olidus；（2）公魚H.transpacificus，分成2個亞種：亞洲公魚H.t.nipponensis和北美公魚H.t.transpacificus；（3）海公魚H.pretiosus，分成太平洋兩岸2個亞種：日本海公魚H.p.japonicus和海公魚H.p.pretiosus.張玉玲［18－19］依據(jù)形態(tài)特征將中國的公魚屬魚類分為3種，分別為池沼公魚H.olidus，日本公魚H.japonicus和西太公魚H.nipponensis.Ilves等人［20］將公魚屬魚類分為5種，分別為H.olidus、H.transpacificus、H.nipponensis、H.pretiosus以及H.japonicus.伊藤等人［21］將分布于日本的公魚屬魚類分為3種，分別為H.olidus、H.transpacificusnipponensis以及H.pretiosusjaponicus.H.transpacificusnipponensis已被移植到日本全國.曹曉霞等［22］依據(jù)形態(tài)特征認為中國移植的公魚為西太公魚H.nipponensis.中國鴨綠江、吉林省和遼寧省一些水庫的西太公魚是20世紀30年代末、40年代初以及70年代、80年代從朝鮮和日本移入，朝鮮半島從上世紀20年代開始從日本移入公魚受精卵［1，23－25］.由于日本西太公魚資源量的減少，從1996年開始每年約1億粒、2000年約4億粒受精卵從中國河北省的西大洋水庫移植放流到日本的霞浦湖.由于中國的西太公魚來源于日本，日本又從中國移植西太公魚的受精卵，所以4個群體西太公魚的聚類圖中，雖然中國的2個群體聚在一起、日本的兩個群體聚在一起.但日本北海道與青森西太公魚間的遺傳距離大于密云水庫與日本北海道間的遺傳距離.從表3還可以看出，于橋水庫、密云水庫、北海道和青森的西太公魚均以單倍型6為 主， 分 別 為 36.36%、38.30%、43.33%、26.67%，表明這4個群體的西太公魚可能是來源于以單倍型6為主的母系祖先.

致謝：在樣本采集過程中，得到天津市薊縣水產(chǎn)局副局長趙仕海研究員、北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所孫向軍副所長、北京市密云縣農(nóng)業(yè)服務(wù)中心胡勇副主任、日本東北大學(xué)教授谷口順彥博士、日本東北大學(xué)副教授池田實博士的支持和幫助，池田實副教授鑒定了在日本所采集的公魚為H.nipponensis（西太公魚），在此表示感謝.

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Genetic diversity in four populations of Smelt GenusH.nipponensisinferred from RFLP of mtDNA D－loop region

CAOXiao－xia1，DONGShi2，3
（1.Tianjin Bohai Vocational Technical College，Tianjin 300402，China；
2.College of Life Science，Tianjin Normal University，Tianjin 300387，China；
3.Tianjin Key Laboratory of Cyto－Genetical and Molecular Regulation，Tianjin 300387，China）

The mtDNA D－loop region ofHypomesusnipponensis（sample size 151）of 4populations（Yuqiao Reservoir in Tianjin，Miyun Reservoir in Beijing，Hokkaido of Japan，Aomori County of Japan）were amplified using PCR.The amplified fragments（about 1.8kbp）were digested by 13restriction endonucleases.There were restriction sites in 8restriction endonucleases（AluⅠ，DraⅠ，HaeⅢ，HindⅢ，HinfⅠ，MboⅠ，TaqⅠandXspⅠ）.AluⅠ，HinfⅠ，MboⅠ，TaqⅠandXspⅠshowed polymorphism and 28haplotypes were formed.36.36%of Yuqiao population，38.3%of Miyun population，26.67%of Aomori population and 43.33%of Hokkaido population were haplotype 6，and the haplotype diversity（h）and nucleotide diversity（π）of four populations are 0.817 1，0.007 981（Yuqiao）；0.814 1，0.007 326（Miyun）；0.779 3，0.007 255（Hokkaido）and 0.882 8，0.009 710（Aomori），respectively.The Rogers’genetic distance ofH.nipponensisbetween Yuqiao and Miyun is minimum （0.149 9）and that between Yuqiao and Aomori is maximum （0.221 5），that between Hokkaido and Miyun is 0.151 1which is smaller than that between Hokkaido and Aomori.

Hypomesusnipponensis；mtDNA D－loop；RFLP；genetic structure

Q959.466

A

1671－1114（2012）01－0074－06

2011－08－11

天津師范大學(xué)引進人才基金資助項目（5RL021）.

曹曉霞（1985—），女，碩士研究生.

董 仕（1959—），男，研究員，博士，主要從事水產(chǎn)動物遺傳育種方面的研究.

（責(zé)任編校 紀翠榮）