張桂芝，劉長(zhǎng)庭，熊瑋，劉東山

揮發(fā)性有機(jī)物混合物對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞系轉(zhuǎn)化及染色體穩(wěn)定性的影響研究

張桂芝，劉長(zhǎng)庭，熊瑋，劉東山

目的為探討化學(xué)混合物聯(lián)合致癌的機(jī)制，揭示惡性轉(zhuǎn)化與染色體不穩(wěn)定性之間的關(guān)系，本研究觀察了揮發(fā)性有機(jī)物(VOC)混合物(以VOCs表示)對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞系BEAS－2B轉(zhuǎn)化和染色體穩(wěn)定性的影響。方法用VOCs作為誘導(dǎo)劑，以液體染毒后測(cè)定BEAS－2B細(xì)胞的半數(shù)致死量(LC50)，以低劑量(8%LC50)對(duì)BEAS－2B細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，獲得誘導(dǎo)細(xì)胞。觀察細(xì)胞生長(zhǎng)特性改變并篩選誘導(dǎo)克隆，然后用細(xì)胞遺傳學(xué)方法(G帶染色法)觀察誘導(dǎo)細(xì)胞染色體畸變情況。結(jié)果BEAS－2B細(xì)胞在VOCs作用后細(xì)胞逐漸變大、變圓，細(xì)胞質(zhì)豐富，并伴有多角形或不規(guī)則形;核嗜堿深染，體積增大，核仁增多;細(xì)胞復(fù)層生長(zhǎng)，排列紊亂，細(xì)胞克隆為無(wú)序的條索狀團(tuán)塊狀排列。經(jīng)VOCs誘導(dǎo)后細(xì)胞倍增時(shí)間〔(1.79±0.02)d〕較對(duì)照細(xì)胞〔(2.08±0.03)d〕縮短，而飽和密度〔(529.1±31.6)×104/ml〕、最大增殖倍數(shù)〔(104.8±6.2)倍〕均高于對(duì)照細(xì)胞〔(321.2±13.1)×104/ml和(54.6±5.4)倍〕，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。VOCs誘導(dǎo)細(xì)胞第15代可在軟瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)形成典型的甚至肉眼可見(jiàn)的陽(yáng)性細(xì)胞克隆，克隆形成率(35.02±7.80)%高于對(duì)照細(xì)胞(0.13±0.05)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。對(duì)照細(xì)胞與誘導(dǎo)細(xì)胞的染色體核型分布比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);誘導(dǎo)細(xì)胞中二倍體(2n=46)比例降低，出現(xiàn)了一定數(shù)量的非整倍體(77條、80條染色體)、大量亞二倍體(＜2n)、超二倍體(＞2n＆＜4n)和多倍體(≥4n)細(xì)胞，其非穩(wěn)定性畸變頻率(67%)高于對(duì)照細(xì)胞(4%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論VOCs可使BEAS－2B細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，并影響細(xì)胞染色體的穩(wěn)定性，使其發(fā)生畸變并向惡性化方向發(fā)展。

揮發(fā)性有機(jī)物;人支氣管上皮細(xì)胞;染色體不穩(wěn)定性

室內(nèi)空氣污染已成為世界各國(guó)廣泛關(guān)注的問(wèn)題，被公認(rèn)為人類健康最危險(xiǎn)的殺手之一。在對(duì)室內(nèi)空氣的檢測(cè)中，共發(fā)現(xiàn)30多種揮發(fā)性有機(jī)物(volatile organic compound，VOC)，某些有害氣體濃度比室外高出10倍甚至幾十倍，其中致癌物質(zhì)、致病病毒有20多種。室內(nèi)VOC大多來(lái)自建筑材料、結(jié)構(gòu)材料、裝飾材料等，其中甲醛、苯、甲苯和二甲苯是較常見(jiàn)的室內(nèi)VOC［1－2］。室內(nèi)VOC污染可持續(xù)6個(gè)月～1年，有的甚至長(zhǎng)達(dá)幾年［3］?，F(xiàn)已證明長(zhǎng)期低濃度接觸VOC會(huì)使人體產(chǎn)生全身變態(tài)反應(yīng)，甚至?xí)斐删邮胰藛T患上癌癥［4］。

先期研究發(fā)現(xiàn)VOC混合物(以VOCs表示)具有與單個(gè)成分不同的化學(xué)性質(zhì)和毒性特征，高劑量時(shí)呈現(xiàn)細(xì)胞致死效應(yīng)，較低劑量時(shí)呈現(xiàn)一種細(xì)胞轉(zhuǎn)化效應(yīng)［5］。為探討VOCs慢性聯(lián)合作用，本研究選取裝修材料中常見(jiàn)的12種VOC組成混合物，觀察其作用于人支氣管上皮細(xì)胞后細(xì)胞生長(zhǎng)特性及染色體穩(wěn)定性的改變，以探討VOCs對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的機(jī)制，揭示染色體不穩(wěn)定性與化學(xué)聯(lián)合致癌之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞永生化人支氣管上皮細(xì)胞系(BEAS－2B)，為軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院二所保存細(xì)胞株，染色體核型為近二倍體。細(xì)胞株含SV40 DNA，表達(dá)T抗原，但不含腺病毒DNA。細(xì)胞以LHC－8無(wú)血清培養(yǎng)液(LHC－8 SERUM－FREE MEDIUM with GLUTAMINE)培養(yǎng)，接種于25 cm2或75 cm2的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，在95%相對(duì)濕度、5%二氧化碳(CO2)、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，每周傳代1次，傳代后3 d換液。

1.1.2 試劑誘導(dǎo)劑VOCs由苯、甲苯、二甲苯等12種有機(jī)物等體積組成，各試劑均為分析純，由北京化學(xué)試劑公司生產(chǎn)。BEAS－2B細(xì)胞(美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù));碘化丙啶(美國(guó)Sigma－Aldrich公司);LHC－8無(wú)血清培養(yǎng)液(美國(guó)Biofluids INC公司);LHC基礎(chǔ)培養(yǎng)液(美國(guó)Biofluids Biobource INC公司);噻唑蘭(MTT，美國(guó)Amersham LIFE SCIENCE公司);6－硫鳥(niǎo)嘌呤(6－TG，美國(guó)Sigma公司);F－12培養(yǎng)基(F－12，美國(guó)GIBCO公司);胰蛋白酶(Try，美國(guó)GIBCO公司);胎牛血清(北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所);瓊脂糖(美國(guó)Promega公司);乙二胺四乙酸二納(EDTA－Na2，美國(guó)Sigma公司);細(xì)胞松弛素B(美國(guó)Sigma公司);二甲基亞砜(DMSO，美國(guó)Sigma公司);其他試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

染毒液配置:1.0 ml VOCs與100%乙醇以1∶1混合，再以LHC－8無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋1 000倍至所需濃度。乙醇的最終濃度不超過(guò)0.1%，以免影響培養(yǎng)細(xì)胞的正常生理生化功能。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞染毒劑量的篩選(MTT法)采用MTT法確定BEAS－2B細(xì)胞對(duì)測(cè)試毒物VOCs的敏感性，并以細(xì)胞存活率計(jì)算出VOCs的半數(shù)致死量(LC50)。按司徒鎮(zhèn)強(qiáng)等［6］方法進(jìn)行操作，結(jié)果以細(xì)胞存活率對(duì)劑量作圖，求出LC50值。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)化和克隆篩選VOCs對(duì)細(xì)胞進(jìn)行低劑量(8%LC50)染毒24 h后，D－h(huán)anks液洗滌3次，加入4 ml LHC－8無(wú)血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至存活細(xì)胞形成克隆，用胰酶消化收集細(xì)胞并轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)瓶，此為染毒轉(zhuǎn)化第1代細(xì)胞。然后每2 d換液1次，穩(wěn)定后改為1次/3 d，每6 d傳代1次，每次接種1×105個(gè)細(xì)胞連續(xù)傳代培養(yǎng)。嚴(yán)密觀察細(xì)胞生長(zhǎng)變化，并驗(yàn)證相關(guān)的生物學(xué)特性后確定為誘導(dǎo)細(xì)胞，以未染毒的BEAS－2B細(xì)胞作為對(duì)照細(xì)胞。

1.2.3 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定常規(guī)消化第10代誘導(dǎo)細(xì)胞及其對(duì)照細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液后以5×104/皿分別接種于21～35個(gè)含3 ml 37℃預(yù)溫LHC－8無(wú)血清培養(yǎng)液的60 mm培養(yǎng)皿中，各組每24 h取3皿進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并計(jì)算均值，按時(shí)給未計(jì)數(shù)的細(xì)胞換液。計(jì)數(shù)持續(xù)到對(duì)照細(xì)胞出現(xiàn)明顯密度抑制為止。以時(shí)間為橫軸，細(xì)胞數(shù)為縱軸(指數(shù))，繪制生長(zhǎng)曲線。按下列公式計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間(doubling time，DT):DT=t×〔log2/(logNt－logN0)〕，其中t代表培養(yǎng)時(shí)間，N0及Nt分別代表接種后及培養(yǎng)t小時(shí)后的細(xì)胞數(shù);同時(shí)，計(jì)數(shù)穩(wěn)定期細(xì)胞數(shù)，計(jì)算單位體積的細(xì)胞均數(shù)，即細(xì)胞生長(zhǎng)飽和密度。

1.2.4 半固體克隆形成實(shí)驗(yàn)用LHC基礎(chǔ)培養(yǎng)液配制1.4%的備用瓊脂糖，高溫高壓滅菌后放入39℃水浴中保溫，用預(yù)溫的LHC－8無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋為0.7%瓊脂糖。以3 ml/皿倒入60 mm帶格培養(yǎng)皿中，鋪制底層、凝固后備用。常規(guī)消化收集第15代誘導(dǎo)細(xì)胞及對(duì)照細(xì)胞，與0.7%瓊脂糖1∶1混勻稀釋為0.35%細(xì)胞瓊脂混合液，加到培養(yǎng)皿中0.7%瓊脂糖凝膠上(細(xì)胞濃度為1×104/皿)，凝固后每皿加入2 ml LHC－8無(wú)血清培養(yǎng)液，每組5皿，靜置培養(yǎng)。每3 d換液1次，4周后鏡下計(jì)數(shù)直徑＞75 μm或細(xì)胞多于50個(gè)的克隆數(shù)，按下列公式計(jì)算克隆形成率:克隆形成率=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%;同時(shí)，挑取陽(yáng)性細(xì)胞克隆繼續(xù)培養(yǎng)后進(jìn)行染色體分析。

1.2.5 細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備培養(yǎng)細(xì)胞50%～60%融合時(shí)，加入秋水仙素(終濃度0.03 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，Gibco trypsin－EDTA消化液消化部分細(xì)胞脫壁，加入1/20體積的Gibco胎牛血清終止消化，離心得到細(xì)胞沉淀;細(xì)胞沉淀經(jīng)低滲、預(yù)固定、固定、二次固定后制備成細(xì)胞懸液，懸液滴于冷凍的潔凈載玻璃片上，文火烘干制備染色體標(biāo)本片，經(jīng)37℃，5～7 d老化，以0.02%胰蛋白酶消化10～15 s，吉姆薩染色。

1.2.6 染色體鏡檢分析方法低倍鏡下(10×10)選擇染色體分散良好、長(zhǎng)短適宜、著色均勻的中期分裂相。油鏡下每株細(xì)胞觀察50～100個(gè)中期分裂細(xì)胞，計(jì)數(shù)染色體數(shù)目。染色體結(jié)構(gòu)分析:觀察25個(gè)中期分裂細(xì)胞，選取至少10個(gè)具有畸變共性的細(xì)胞進(jìn)行顯微攝影。照片沖洗放大后，參照人標(biāo)準(zhǔn)核型進(jìn)行核型分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0分析軟件，計(jì)量資料以(±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn);VOCs LC50分別以作圖法進(jìn)行計(jì)算，同時(shí)采用概率單位法(PROBIT)進(jìn)行驗(yàn)證;其他數(shù)據(jù)依據(jù)其性質(zhì)分別采用計(jì)數(shù)資料的χ2檢驗(yàn)或非參數(shù)檢驗(yàn)的秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VOCs細(xì)胞染毒劑量的篩選結(jié)果由圖1可知，VOCs的LC50為0.82 g/L，PROBIT計(jì)算所得LC50為1.10 g/L，經(jīng)擬和優(yōu)度的χ2檢驗(yàn)(Pearson Goodness－of fit Chi Squre)，χ2=912.661，P＜0.01，不接受“對(duì)稱S形曲線”的假設(shè)，認(rèn)為可信區(qū)間(CI)計(jì)算中未使用非齊同因素，95%CI為(0.99，2.05)g/L。本研究以8%LC50(0.068 g/L)作為細(xì)胞的誘導(dǎo)劑量，即12.5 μl/ml培養(yǎng)液體系對(duì)BEAS－2B細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，待長(zhǎng)期培養(yǎng)后篩選陽(yáng)性克隆用于染色體分析。

2.2 誘導(dǎo)細(xì)胞的形態(tài)變化光鏡下觀察:正常的BEAS－2B細(xì)胞多為梭形，大小均勻，細(xì)胞質(zhì)較少，細(xì)胞間連接較緊密;細(xì)胞核多呈橢圓形，單個(gè)核仁;單層生長(zhǎng)，排列有序或放射狀，有明顯接觸抑制和密度抑制(見(jiàn)圖2)。而VOCs誘導(dǎo)細(xì)胞體積變大，呈圓形或類圓形，常伴有多角形不規(guī)則形，細(xì)胞質(zhì)豐富;核嗜堿深染，核仁1個(gè)至數(shù)個(gè)不等;復(fù)層生長(zhǎng)，排列不規(guī)則，呈現(xiàn)無(wú)序團(tuán)塊狀，無(wú)明顯接觸抑制和密度抑制(見(jiàn)圖3)。

2.3 細(xì)胞生長(zhǎng)特性VOCs作用初期，對(duì)照細(xì)胞和誘導(dǎo)細(xì)胞的生長(zhǎng)速度相差不大，誘導(dǎo)細(xì)胞自第5天開(kāi)始生長(zhǎng)速度加快，第12天時(shí)對(duì)照細(xì)胞已出現(xiàn)接觸抑制和密度抑制，呈現(xiàn)明顯飽和狀態(tài)，細(xì)胞已不再增殖，達(dá)到細(xì)胞培養(yǎng)的最大密度時(shí)間，而此時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞仍可繼續(xù)增殖(見(jiàn)圖4);此時(shí)，誘導(dǎo)細(xì)胞倍增時(shí)間、飽和密度及最大增殖倍數(shù)與對(duì)照細(xì)胞比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，見(jiàn)表1)。

圖1 混合液中VOCs－MTT細(xì)胞存活曲線Figure 1 The suevival curve of BEAS－2B cells induced by VOC mixture

圖3 VOCs誘導(dǎo)細(xì)胞(HE染色，10×10)Figure 3 The induced cells by VOCs(HE，10×10)

表1 對(duì)照細(xì)胞及誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的特性(±s)Table 1 The characters of growth curve of BEAS－2B and induced cells

表1 對(duì)照細(xì)胞及誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的特性(±s)Table 1 The characters of growth curve of BEAS－2B and induced cells

組別細(xì)胞倍增時(shí)間(d)飽和密度(×104/ml)最大增殖倍數(shù)(倍)2.08±0.03321.2±13.154.6±5.4誘導(dǎo)細(xì)胞組1.79±0.02529.1±31.6104.8±6.2 t對(duì)照細(xì)胞組80.43－61.87－60.41 P值值0.0000.0000.000

2.4 半固體克隆形成率通常情況下，對(duì)照細(xì)胞(即正常BEAS－2B細(xì)胞)不能在半固體瓊脂中生長(zhǎng);而VOCs誘導(dǎo)細(xì)胞第15代失去接觸抑制具有錨著獨(dú)立性生長(zhǎng)能力，能夠在半固體瓊脂中形成集落(見(jiàn)圖5)，其半固體克隆形成率(35.02±7.80)%與對(duì)照細(xì)胞(0.13±0.05)%比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=－44.70，P＜0.01)。

圖4 對(duì)照細(xì)胞及誘導(dǎo)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線Figure 4 The growth curves of control BEAS－2B and induced cells

2.5 VOCs誘導(dǎo)細(xì)胞染色體核型的變化

2.5.1 染色體數(shù)目的變化對(duì)照細(xì)胞與誘導(dǎo)細(xì)胞的染色體核型分布比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);對(duì)照細(xì)胞(即正常BEAS－2B細(xì)胞)的染色體數(shù)目以二倍體核型(2n=46)為主，亞二倍體(＜2n)、多倍體(≥4n)很少，且傳代過(guò)程中保持穩(wěn)定;而誘導(dǎo)細(xì)胞二倍體核型比例下降，以超二倍體(＞2n＆＜4n)及多倍體為主，多倍體多見(jiàn)(見(jiàn)表2)。

表2 對(duì)照細(xì)胞和誘導(dǎo)細(xì)胞染色體核型分布情況比較(%)Table 2 The chromosome karyotype ratio of induced cells and control BEAS－2B cells

2.5.2 染色體結(jié)構(gòu)的改變對(duì)照細(xì)胞代表核型為二倍體(2n=46)，但其5、15、16號(hào)染色體各丟失1條染色體，呈單體型狀態(tài)，而相同位置各有1條未知染色體分別與各染色單體配對(duì)，且這3條染色體在傳代過(guò)程中穩(wěn)定表達(dá)，因此將其作為BEAS－2B細(xì)胞的標(biāo)記染色體，分別表示為M1、M2、M3?？梢?jiàn)，BEAS－2B細(xì)胞是單體型混合配對(duì)的假二倍體細(xì)胞，其典型核型見(jiàn)圖6。

圖6 對(duì)照細(xì)胞(正常BEAS－2B細(xì)胞)核型2n=46，XY，－5，－15，－16，+M1，+M2，+M3Figure 6 The karyotype of BEAS－2B cell(G－banding)2n=46，XY，－5，－15，－16，+M1，+M2，+M3

圖7 VOCs誘導(dǎo)細(xì)胞的多倍體圖像(箭頭示dic/tri)Figure 7 The structural changes of chromosomes of polyploid induced cell(dic，ace)

誘導(dǎo)細(xì)胞核型為多倍體，與對(duì)照細(xì)胞相比有較大變化，出現(xiàn)一定數(shù)量的非整倍體(77條、80條染色體)，說(shuō)明染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的丟失和重排，同時(shí)可見(jiàn)數(shù)對(duì)雙著絲粒(dic)或三著絲粒(tri)染色體(見(jiàn)圖7)。2.5.3 多倍體核型非穩(wěn)定性畸變對(duì)照細(xì)胞與誘導(dǎo)細(xì)胞非穩(wěn)定性畸變結(jié)果見(jiàn)表3，顯示在所計(jì)數(shù)的100個(gè)細(xì)胞中，對(duì)照細(xì)胞總的非穩(wěn)定性畸變〔染色體易位(t)和染色體增長(zhǎng)(+)〕發(fā)生頻數(shù)為4%(4/100);誘導(dǎo)細(xì)胞總的非穩(wěn)定性畸變〔dic、tri、ace、環(huán)狀染色體(r)、t、+〕發(fā)生頻數(shù)為67%(67/100)，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

表3 對(duì)照細(xì)胞和誘導(dǎo)細(xì)胞染色體非穩(wěn)定性畸變發(fā)生頻率(%)Table 3 The non－stabilizing chromosome aberration frequency of control BEAS－2B cells and induced cells

3 討論

自從1914年德國(guó)科學(xué)家Boveri提出惡性細(xì)胞存在遺傳不穩(wěn)定性以來(lái)，人類對(duì)遺傳不穩(wěn)定性與腫瘤的關(guān)系已有了一定的認(rèn)識(shí)。人類腫瘤細(xì)胞中存在兩種類型的基因組不穩(wěn)定，一種是錯(cuò)配修復(fù)基因突變導(dǎo)致的核苷酸水平的遺傳不穩(wěn)定性，稱為微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability，MIN);另一種是在染色體水平產(chǎn)生的遺傳不穩(wěn)定性，稱為染色體不穩(wěn)定性(chromosome instability，CIN)［7］。CIN主要包括染色體結(jié)構(gòu)異常和數(shù)目異常。結(jié)構(gòu)異常包括雜合缺失、染色體易位、重排、基因擴(kuò)增導(dǎo)致的染色體均染區(qū)、雙微體等;數(shù)目異常主要是非整倍體。CIN是人類實(shí)體瘤中常見(jiàn)的現(xiàn)象之一，目前的研究表明其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中有重要作用［8］。

本研究發(fā)現(xiàn)，永生化的BEAS－2B細(xì)胞在VOCs作用后細(xì)胞逐漸變大、變圓，細(xì)胞質(zhì)豐富，并伴有多角形或不規(guī)則形;核嗜堿深染，體積增大，核仁增多;細(xì)胞復(fù)層生長(zhǎng)，排列紊亂，細(xì)胞克隆為無(wú)序的條索狀團(tuán)塊狀排列。經(jīng)VOCs誘導(dǎo)后細(xì)胞生長(zhǎng)加快，倍增時(shí)間縮短，呈現(xiàn)無(wú)限增殖趨勢(shì)，無(wú)明顯的接觸抑制和密度抑制。誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化后期已具有很強(qiáng)的錨著獨(dú)立性生長(zhǎng)能力，可在軟瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)形成典型的甚至肉眼可見(jiàn)的陽(yáng)性細(xì)胞克隆，克隆形成率為(35.02±7.80)%，顯著高于對(duì)照細(xì)胞的(0.13±0.05)%，說(shuō)明誘導(dǎo)細(xì)胞的遺傳性狀發(fā)生改變，具備了慢性轉(zhuǎn)化特性，完成了癌前轉(zhuǎn)化，極有可能轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞。因?yàn)槟茉谲洯傊橘|(zhì)中形成克隆標(biāo)志著細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。

造成染色體不穩(wěn)定的染色體數(shù)量變化通常是有絲分裂過(guò)程中染色體錯(cuò)誤分離的結(jié)果。本研究染色體分析發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)細(xì)胞中二倍體(2n=46)比例顯著降低，出現(xiàn)了一定數(shù)量的非整倍體(77條、80條染色體)、大量亞二倍體(＜2n)、超二倍體(＞2n＆＜4n)和多倍體(≥4n)細(xì)胞;而誘導(dǎo)細(xì)胞則以多倍體最為突出。這種染色體眾數(shù)(modal number)由二倍體向近二倍體、非整倍體、多倍體轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)，代表著細(xì)胞增殖失控、核分裂加速，染色體復(fù)制過(guò)程錯(cuò)誤率升高，核漿分裂失衡等增生細(xì)胞的特性;同時(shí)多倍體細(xì)胞群體的形成與誘導(dǎo)細(xì)胞全面惡性表型和致瘤性的獲得，與細(xì)胞轉(zhuǎn)化啟動(dòng)、增殖分化失控和多倍體克隆的急劇擴(kuò)增有直接關(guān)系。非穩(wěn)定性畸變作為非平衡的互換畸變，其直接后果是引起細(xì)胞死亡。誘導(dǎo)細(xì)胞有大量非穩(wěn)定性畸變(dic、tri、ace、r、t、+)，其非穩(wěn)定性畸變頻率為67%，顯著高于對(duì)照細(xì)胞的4%。說(shuō)明攜帶有非穩(wěn)定性畸變的細(xì)胞在傳代選擇過(guò)程中不僅未失去分裂增殖能力，反而獲得了明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。這表明在長(zhǎng)期低濃度VOCs存在時(shí)，支氣管上皮細(xì)胞系染色體不穩(wěn)定性逐漸增加，易發(fā)生各類畸變并向惡性化方向轉(zhuǎn)化，可能導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。有研究表明細(xì)胞染色體畸變率與肺癌臨床分期密切相關(guān)［9］，染色體畸變分析有望作為臨床肺癌診斷及分期判斷的一項(xiàng)有意義的實(shí)驗(yàn)室檢查手段。

雖然多項(xiàng)研究表明發(fā)生于體外細(xì)胞的癌變過(guò)程中，細(xì)胞遺傳學(xué)的改變與體內(nèi)細(xì)胞癌變歷程中染色體的異常非常接近，分析誘導(dǎo)細(xì)胞的染色體核型將有助于了解機(jī)體細(xì)胞癌變過(guò)程中所發(fā)生的細(xì)胞遺傳學(xué)改變;但化學(xué)致癌過(guò)程畢竟是以細(xì)胞生長(zhǎng)和分化逐步失控，歷經(jīng)啟動(dòng)(initation)、促進(jìn)(promotion)和演進(jìn)(progression)各階段的多步驟過(guò)程。本研究所得的體外環(huán)境下VOCs對(duì)BEAS－2B細(xì)胞誘導(dǎo)研究，一方面可以作為下一步研究基因、蛋白水平致癌機(jī)制的啟示;另一方面，還要充分考慮VOCs與人體正常支氣管上皮細(xì)胞實(shí)際的作用機(jī)制及其相應(yīng)的毒性機(jī)制。今后研究中在探討細(xì)胞毒性作用機(jī)制的同時(shí)，必須結(jié)合動(dòng)物毒理學(xué)研究和人群流行病學(xué)結(jié)果，這樣才能真正揭示化學(xué)混合物(如VOCs)對(duì)機(jī)體細(xì)胞的化學(xué)致癌機(jī)制。

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9 熊瑋，黃桂君，錢(qián)桂生，等.肺癌染色體畸變分析［J］．重慶醫(yī)學(xué)，2002，31(9):776－777.

Study of the Effect of Volatile Organic Compounds on the Transformation and Chromosomal Instability of Human Bron-chial Epithelial

ZHANG Gui－zhi，LIU Chang－ting，XIONG Wei，et al.Department of Respiratory Diseases，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China

ObjectiveTo investigate the co－carcinogenic mechanisms of chemical mixtures and reveal the relationship between malignant transformation and chromosome instability.This study observed the impact of a mixture of volatile organic compounds(VOCs)on the transformation and chromosome stability of human bronchial epithelial cell line BEAS－2B in vitro.MethodsVOCs worked as inducers and were used to determine the median lethal dose of BEAS－2B(LC50)after contamination;BEAS－2B cells were induced by low dose of LC50(8%LC50)and then got the induced cells.The characteristics change of cell growth was observed and the induced clone was filtered，the induction of chromosome aberrations was observed by using cytogeneticMethods(G band staining)then.ResultsAfter VOCs induction，BEAS－2B cells gradually became large and roungded，abundant cytoplasm，accompanied with polygon or irregular shape;the nuclear of the cells were basophilic hyperchromatic，the volume and the nucleoli of the nuclear were increased;the growth of the cells tend to be multi－layered with disordered arrangement，the cell clones arranged disorderly cord－like lumps.The doubling time of VOCs induced cells was significantly shortened compared with that of the control cells〔(1.79±0.02)d VS(2.08±0.03)d〕，the saturation density and the biggest proliferation multiples were significantly higher than those of the control cells〔(529.1±31.6)×104/ml VS(321.2±13.1)×104/ml;(104.8±6.2)times VS(54.6±5.4)times，P＜0.01〕.The 15th generation of VOCs induced cells formed typical even visible positive cell clones on soft agar medium，clone formation rate was significantly higher than that of control cells〔(35.02±7.80)%VS(0.13±0.05)%，P＜0.01〕.The karyotype distributions of control cells and induced cells had statistically significant difference(P＜0.01)．The proportion of the diploid(2n=46)in the induced cells was significantlylower.A certain number of aneuploid〔77，(＞2n＆＜4n)，chromosome 80〕，a large number of hypodiploid(＜2n)，hyperdiploid and polyploid cells(≥4n)appeared;the non－stability chromosome aberration frequency was 67%，accompanied by a large number of non－stability aberrations(dic，tri，ace，r，t，+)which all significantly higher than those of the control cells(P＜0.01).ConclusionVOCs could induce the transformation of BEAS－2B cells;it could also affect the stability of the cell chromosome，cause aberration and make cell transformation to malignization direction.

Volatile organic compounds;Human bronchial epithelial cells;Chromosomal instability

R 394.224

A

1007－9572(2012)11－3861－05

10.3969/j.issn.1007－9572.2012.11.097

100853北京市，中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院南樓呼吸科(張桂芝，劉長(zhǎng)庭);第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院呼吸科(熊瑋);中國(guó)疾病預(yù)防控制中心公共衛(wèi)生管理處(劉東山)

劉東山，100050北京市，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心公共衛(wèi)生管理處;E－mail:martinliuer1204@yahoo.com.cn

2012－08－13;

2012－10－24)

(本文編輯:劉莉)