范海燕，楊華，李勝棉，郭占軍

線粒體D－環(huán)區(qū)單核苷酸多態(tài)性與食管癌患者預(yù)后關(guān)系的研究

范海燕，楊華，李勝棉，郭占軍

目的探討線粒體D－環(huán)區(qū)(D－loop區(qū))單核苷酸多態(tài)性與食管癌患者預(yù)后的關(guān)系。方法選擇2003—2004年在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院胸外科住院行食管癌根治性手術(shù)切除的食管癌患者55例，采用聚合酶鏈反應(yīng)對(duì)其手術(shù)切除標(biāo)本進(jìn)行線粒體D－loop區(qū)測(cè)序。通過(guò)電話(huà)對(duì)患者進(jìn)行隨訪并計(jì)算5年生存率，分析其與患者臨床特征的關(guān)系。參照基因數(shù)據(jù)庫(kù)AC_000021號(hào)從已完成的食管癌患者線粒體D－loop區(qū)1 000 bp序列中找出單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，分析不同單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與患者5年生存率的關(guān)系。結(jié)果本組55例患者均完成了5年的隨訪，共生存20例。不同性別、年齡(以55歲為界)及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移食管癌患者5年生存率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);不同TNM分期食管癌患者5年生存率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。共找出88個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，采用Kaplan－Meier方法繪制生存曲線發(fā)現(xiàn)，僅16278和16399位點(diǎn)與食管癌患者的生存期有關(guān)。16278T型食管癌患者與16278C型患者、16399G型食管癌患者與16399A型患者5年生存率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為9.413和11.225，P＜0.05)。采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析發(fā)現(xiàn)，16278T/C〔OR=3.638，95%CI(1.191，11.111)〕和16399G/A〔OR=5.096，95%CI(1.647，15.769)〕是食管癌患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子(P＜0.05)。結(jié)論線粒體D－loop區(qū)單核苷酸多態(tài)性可作為食管癌患者預(yù)后的預(yù)測(cè)因子，有助于早期判斷食管癌患者預(yù)后，更好地指導(dǎo)臨床治療，對(duì)估計(jì)生存期較短的術(shù)后患者可給予更積極的輔助治療，以提高患者生存率。

多態(tài)性，單核苷酸;線粒體DNA;食管鱗狀細(xì)胞癌;預(yù)后

食管癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，我國(guó)北方地區(qū)為食管癌高發(fā)區(qū)，年發(fā)病率＞125/100 000，累積病死率男性約為20%，女性約為25%［1］。盡管近年來(lái)食管癌的診斷和治療有了長(zhǎng)足發(fā)展，但由于其侵襲性較高，患者的預(yù)后仍較差。研究發(fā)現(xiàn)，患者的一般狀況、TNM分期和局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等是食管癌患者預(yù)后的預(yù)測(cè)因子;一些分子機(jī)制的改變?nèi)鏟53基因突變和核因子κB(NF－κB)表達(dá)水平也可能影響食管癌患者的預(yù)后［2］。

線粒體DNA(mtNDA)處在活性氧自由基和其他自由基包圍之中，缺乏組蛋白保護(hù)，且其內(nèi)部缺乏完整的修復(fù)系統(tǒng)，與核內(nèi)基因相比，mtDNA較容易發(fā)生突變［3］。線粒體D－環(huán)區(qū)(D－loop區(qū))由1 122 bp組成(核苷酸16024－16569位點(diǎn)和1－576位點(diǎn))，含有復(fù)制起始點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，多種腫瘤細(xì)胞中存在mtDNA廣泛變異，近年來(lái)包括食管癌在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞中線粒體D－loop區(qū)已成為基因突變和多態(tài)性研究的熱點(diǎn)［4－5］。本研究旨在探討線粒體D－loop區(qū)單核苷酸多態(tài)性(SNPs)與食管癌患者預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2003—2004年河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院胸外科住院行食管癌根治性手術(shù)切除的食管癌患者55例，其中男34例，女21例;年齡39～76歲，平均(59.3±8.6)歲;患者ECOG評(píng)分(美國(guó)東部腫瘤協(xié)作組Eastern Cooperative Oncology Group制定的腫瘤活動(dòng)狀態(tài)評(píng)分)均為0分，術(shù)前均未進(jìn)行任何臨床藥物治療及放、化療;患者均來(lái)自中國(guó)河北省食管癌高發(fā)地區(qū)，術(shù)后腫瘤切除標(biāo)本經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)均為鱗狀細(xì)胞癌。

1.2 檢測(cè)方法患者術(shù)前均空腹抽取外周靜脈血，當(dāng)天提取線粒體后置于－80℃恒溫冰箱保存。采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法提取mtDNA，全血mtDNA萃取試劑盒由美國(guó)Madison生產(chǎn)。迅速擴(kuò)增mtDNA的D－loop區(qū)，擴(kuò)增上游引物為5'－C CCCATGCTTACAAGCAAGT－3'，下游引物為5'－GCTTTGAGGAGGTAAGCTAC－3'，長(zhǎng)度為1 000 bp，擴(kuò)增參數(shù)按照劑盒說(shuō)明。使用美國(guó)ABI PRISM 3100 DNA序列分析儀將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化測(cè)序，同一標(biāo)本采用雙向重復(fù)測(cè)序。

1.3 觀察指標(biāo)通過(guò)電話(huà)對(duì)患者進(jìn)行隨訪并計(jì)算5年生存率，分析其與患者臨床特征的關(guān)系。參照基因數(shù)據(jù)庫(kù)AC_000021號(hào)從已完成的食管癌患者線粒體D－loop區(qū)1 000 bps序列中找出SNPs位點(diǎn)，分析不同SNPs位點(diǎn)與患者5年生存率的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，采用Kaplan－Meier方法繪制生存曲線，組間比較采用log－rank檢驗(yàn);采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行多因素分析，以相對(duì)危險(xiǎn)度(OR)及其95%可信區(qū)間(95%CI)表示;以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管癌患者臨床特征與5年生存率的關(guān)系本組55例患者均完成了5年的隨訪，共生存20例。不同性別、年齡(以55歲為界)及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移食管癌患者5年生存率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);不同TNM分期食管癌患者5年生存率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見(jiàn)表1)。

表1 食管癌患者臨床特征與5年生存率的關(guān)系(n=55)Table 1 Relationship between clinical characteristics and 5－year survival rate in ESCC patients

2.2 線粒體D－loop區(qū)SNPs與患者5年生存率的關(guān)系共找出88個(gè)SNPs位點(diǎn)，繪制生存曲線發(fā)現(xiàn)，僅16278和16399位點(diǎn)與食管癌患者的生存期有關(guān)。16278T型食管癌患者與16278C型患者、16399G型食管癌患者與16399A型患者5年生存率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為9.413和11.225，P＜0.05，見(jiàn)圖1、2)。

圖1 多態(tài)位點(diǎn)16278CC與TT基因型患者5年生存率比較Figure 1 Comparison of 5－year survival rate between the patients with 16278CC or TT allele

圖2 多態(tài)位點(diǎn)16399AA與GG基因型患者生存期比較Figure 2 Comparison of 5－year survival rate between the patients with 16399AA or GG allele

2.3 多因素分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析TNM分期，16278T/C、16399G/A基因型與患者5年生存率的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，16278T/C、16399G/A是食管癌患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子(P＜0.05，見(jiàn)表2)。

表2 食管癌患者Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型5年生存率多因素分析Table 2 Multivariate analysis of prognostic factors associated with 5－year survival rate in ESCC patients by Cox proportional hazards model

3 討論

mtDNA是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)惟一的核外遺傳物質(zhì)。1981年Anderson等首次在《Nature》雜志上公布了人類(lèi)mtDNA基因組的全部核苷酸序列，并繪制了詳細(xì)的功能圖譜。研究表明，mtDNA氧化損傷可能與人類(lèi)衰老、神經(jīng)退行性疾病、糖尿病以及腫瘤等疾病的發(fā)生有關(guān)［6］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，很多實(shí)體惡性腫瘤存在高頻率的mtDNA突變。D－loop區(qū)是mtDNA的非編碼區(qū)，是mtDNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點(diǎn)。對(duì)頭頸部腫瘤、膀胱癌、乳腺癌等進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，D－loop區(qū)是mtDNA突變的熱點(diǎn)區(qū)域［7］。SNPs是指染色體基因組水平上單個(gè)核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，已成為繼限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)標(biāo)志和微衛(wèi)星標(biāo)志后的第三代遺傳標(biāo)志，其在多基因疾病的易感基因研究領(lǐng)域應(yīng)用較廣。線粒體D－loop區(qū)SNPs位點(diǎn)與多種腫瘤的致癌風(fēng)險(xiǎn)和疾病預(yù)后有關(guān)［8－9］。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，16278T型食管癌患者5年生存率低于16278C型患者，16399G型食管癌患者5年生存率低于16399A型患者;16278C/T和16399A/G基因型與食管癌患者預(yù)后相關(guān)，是食管癌患者預(yù)后獨(dú)立的預(yù)測(cè)因子。16278T基因型患者死亡風(fēng)險(xiǎn)是16278C基因患者3.638倍，16399G基因型患者死亡風(fēng)險(xiǎn)是16399A基因型患者的5.096倍。提示mtDNA D－loop區(qū)含有這兩個(gè)基因型多肽位點(diǎn)者有罹患食管癌的傾向，預(yù)后可能更差。

線粒體D－loop區(qū)在線粒體基因復(fù)制和表達(dá)過(guò)程中起著重要作用，這個(gè)區(qū)域的基因突變有可能影響mtDNA復(fù)制并導(dǎo)致氧化呼吸鏈的改變，導(dǎo)致大量活性氧自由基釋放而損傷細(xì)胞核基因組，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用［10－11］。SNPs位點(diǎn)16278和16399位于線粒體D－loop高變區(qū)1(HV1)，此序列具有高突變率，但其具體作用機(jī)制尚未明確［12］，可能是使線粒體基因組轉(zhuǎn)錄發(fā)生改變，導(dǎo)致大量活性氧自由基產(chǎn)生，而氧自由基調(diào)節(jié)機(jī)制異常促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，進(jìn)而影響患者的預(yù)后。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，食管癌患者的性別、年齡、有無(wú)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與其5年生存率無(wú)關(guān)，而TNM分期與5年生存率有關(guān)，但性別、年齡、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與患者生存時(shí)間的關(guān)系都顯示有差異趨勢(shì)，可能與本研究樣本量較小、觀察時(shí)間較短有關(guān)，有待進(jìn)一步增加樣本量，延長(zhǎng)隨訪時(shí)間進(jìn)行深入研究。

總之，線粒體D－loop區(qū)SNPs可作為食管癌患者預(yù)后的預(yù)測(cè)因子，有助于早期判斷食管癌患者預(yù)后，更好地指導(dǎo)臨床治療，對(duì)估計(jì)生存期較短的術(shù)后患者可給予更積極的輔助治療，以提高患者生存率。長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看，應(yīng)建立以mtDNA D－loop序列的SNPs分析為平臺(tái)的食管癌預(yù)后評(píng)價(jià)系統(tǒng)，并推廣應(yīng)用于其他消化道惡性腫瘤分子研究。

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Relationship between Single Nucleotide Polymorphisms in Mitochondrial Displacement－loop and Prognosis of Esophage-al Squamous Cell Car

FAN Hai－yan，YANG－h(huán)ua，LI Sheng－mian，et al.Department of Gastroenterology and Hepatology，the Fourth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011，China

ObjectiveTo study the relationship between single nucleotide polymorphisms(SNPs)in mitochondrial DNA(mtDNA)displacement－loop(D－loop)region and prognosis of patients with esophageal squamous cell carcinoma(ESCC).Methods55 ESCC patients underwent radical operation in department of thoracic surgery of the Fourth Hospital of Hebei Medical University from 2003 to 2004 were selected.The D－loop region of mtDNA was sequenced by using polymerase chain reaction method.The patients were followed up by telephone for five years，and then the five year survival rate was calculated and its relationship with clinical features was analyzed.AC_000021 database was referred to in order to find SNPs from the 1 000－bp mitochondria D－Loop region，and the relationship between SNPs and five year survival rate was analyzed.ResultsAll the 55 patients completed the five－year following up and 20 cases survived.The survival rate between patients with different sex，age(55 as dividing line)and whether there was lymphatic metastasis or not showed no statistically significant differences(P＞0.05).The five－year survival rate between patients with different TNM staging showed statistically significant difference(P＜0.05).88 SNPs sites were detected in the 1 000－bp mitochondria D－Loop region.When drawing the survival curves with Kaplan－Meier method，only SNP sites of nucleotides 16278C/T and 16399A/G showed correlation with the survival of patients.The five－year survival rate between patients with 16278T and 16278C and patients with 16399G and 16399A both showed statistically significant differences(χ2=9.413 and 11.225，P＜0.05).Cox proportional hazards regression models showed that 16278T/C〔OR=3.638，95%CI(1.191，11.111)〕and 16399G/A〔OR=5.096，95%CI(1.647，15.769)〕were independent risk factors for the prognosis of ESCC patients.ConclusionSNPs in the D－loop are independent prognostic factors for patients with ESCC and it is conducive to the early prediction of the prognosis of ESCC patients.Positive adjuvant therapy should be performed on patients with estimated shorter survival to improve their survival rate.

Polymorphism，single nucleotide;Mitochondrial DNA;Esophageal squamous cell carcinoma;Prognosis

R 735.1

A

1007－9572(2012)11－3839－03

10.3969/j.issn.1007－9572.2012.11.090

050011河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院消化內(nèi)科

郭占軍，050011河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院消化內(nèi)科;E－mail:zjguo5886@yahoo.com.cn

2012－06－10:

2012－09－21)

(本文編輯:鹿飛飛)