鄒 軍，霍生東

（1.甘肅省康縣畜牧局，隴南 746500；2.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730030）

最近幾年，我國在生物技術(shù)和胚胎工程技術(shù)上有很大的進(jìn)步，因而對(duì)胚胎的需求量越來越大，而卵母細(xì)胞的成熟發(fā)育能力與胚胎有著緊密的聯(lián)系。所以在動(dòng)物體外生產(chǎn)并保存大量?jī)?yōu)質(zhì)的卵母細(xì)胞，對(duì)提高優(yōu)良母畜的繁殖力非常重要。因此，完善未成熟卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)體系，提高它的體外成熟率極其重要。在卵母細(xì)胞的體外成熟過程中，參與成熟的因子較多［1-2］，激素是影響其成熟的重要因子。

hCG是動(dòng)物下丘腦分泌的一類含氮類激素，分泌后先貯存在下丘腦內(nèi)，機(jī)體在需要時(shí)才進(jìn)入臨近的毛細(xì)血管，運(yùn)輸?shù)绞荏w器官發(fā)揮作用。hCG的一個(gè)重要受體就是卵巢，卵巢主要的功能就是產(chǎn)生并使卵泡成熟。因此，預(yù)測(cè)hCG參與了卵母細(xì)胞的成熟。已有的研究表明，hCG可以提高人和狗卵母細(xì)胞的體外成熟率［3-4］，而對(duì)小鼠卵母細(xì)胞的成熟率沒有影響［5］。因此，本試驗(yàn)主要通過改變培養(yǎng)液中hCG的濃度來改變未成熟卵母細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境，探求hCG是否對(duì)綿羊卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)存在影響，為卵母細(xì)胞體外成熟的研究提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 卵巢的采集與保存

從蘭州屠宰場(chǎng)獲取綿羊卵巢。方法是在綿羊屠宰剖腹后，立即無菌采取羊的卵巢，放于已準(zhǔn)備好的裝有含青、鏈霉素的生理鹽水的保溫瓶（35～37℃）中，4～5 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 綿羊卵母細(xì)胞的采集

將運(yùn)回到實(shí)驗(yàn)室的卵巢放在滅菌濾紙上，用滅菌好的手術(shù)器械將其表面多余的脂肪和組織去除掉，再用生理鹽水清洗3次后，放在裝有經(jīng)培養(yǎng)箱平衡過夜處理的培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，用機(jī)械切割法將其剪碎，然后放在二氧化碳培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)35min，最后在顯微鏡下檢卵。

1.3 卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)

將采集到的COCs用洗卵液（成分:TCM199（GIBICO BRL.Lot No.1090233）+510 mmol/L NaHCO3+5.0 mmol/L Hepes+2%發(fā)情牛血清（OCS））清洗3～4遍，然后在基礎(chǔ)成熟液（成分:TCM199（GIBICO BRL.Lot No.1090233）+10%FBS+0.22mg/L丙酮酸鈉+25mmol/L Hepes+2.2g/L NaHCO3+100u/mL青霉素+100μg/mL鏈霉素）中清洗1～2遍，放于含有2 mL基礎(chǔ)成熟液+hCG的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24h。

2 結(jié)果

由表1可知，卵母細(xì)胞經(jīng)體外成熟24 h后，5、10、15 u/L hCG處理組的成熟率（45.16%、47.17%、48.05%）雖略低于對(duì)照組（52.49%），但均差異不顯著（P＞0.05）；不同濃度hCG組間亦無顯著差異（P＞0.05）。說明在體外成熟培養(yǎng)液中添加hCG不影響綿羊卵母細(xì)胞體外成熟。

表1 不同濃度hCG對(duì)綿羊卵母細(xì)胞體外成熟的影響

圖1 綿羊卵母細(xì)胞（A未成熟，B成熟）

3 分析與討論

hCG全稱是人絨毛膜促性腺激素，是一種含氮類的胎盤激素，由α和β兩個(gè)亞基組成，產(chǎn)生于人妊娠后第7天子宮內(nèi)膜滋養(yǎng)層細(xì)胞，主要生理作用是促進(jìn)排卵及黃體的生成，以及促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育，常用于催情，它的生理特性與LH類似［6］。

曾有人報(bào)道，若用hCG對(duì)未成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行前期預(yù)處理，就會(huì)使未成熟卵母細(xì)胞的發(fā)育潛力得到提高。但Ge等曾通過將卵母細(xì)胞直接放在裝有含hCG的體外成熟培養(yǎng)液中進(jìn)行成熟培養(yǎng)，結(jié)果得出對(duì)未成熟卵母細(xì)胞的體外成熟率沒有顯著改變，hCG并沒有使它的成熟率提高［7］。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了1個(gè)空白對(duì)照組及低、中、高3個(gè)處理組，3個(gè)處理組中添加了不同濃度的hCG。將未成熟卵母細(xì)胞放在4個(gè)組中進(jìn)行培養(yǎng)，在經(jīng)過體外成熟培養(yǎng)24 h后，雖然3個(gè)處理組的卵母細(xì)胞成熟率略低于對(duì)照組，但其之間差異均不顯著，而且3個(gè)處理組卵母細(xì)胞成熟率也沒有顯著差異。由此推斷，hCG對(duì)綿羊卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)沒有顯著影響。

［1］霍生東，龍玲，阿依木古麗，等.光照及溫度對(duì)小鼠卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的影響［J］.貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（12）:170-171.

［2］蔡令波，王峰，顧熟琴，等.PMSG和hCG對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響［J］.畜牧與獸醫(yī)，2002，34（12）:1-2.

［3］Lin Y H，W ang J L.Effect of FSH priming and hCG priming for on in vitro maturation of canine oocytes［J］.Human Report，2003，18：1632-1636.

［4］De los Reyes M，Lange J，Miranda P，et al.Effect of human chorionic gonadotrophin supplementation during different culture periods on in vitro maturation of canine oocytes［J］.Theriogenology，2005，64（1）:1-11.

［5］趙雁偉.LH和hCG對(duì)昆明小鼠卵母細(xì)胞體外成熟的影響［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2008，18（2）:23-27.

［6］趙興緒.獸醫(yī)產(chǎn)科學(xué)［M］.4 版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2010：37.

［7］Ge H S，Huang X F,Zhang W，et al.Exposure to human chorionic gonadotropin during in vitro maturation does not improve the maturation rate and developmental potential of immature oocytes from patients with polycystic ovary syndrome［J］.Fertili Steril，2008，89（1）：98-103.