曲家華，周慶民，馮萬(wàn)宇

（黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，齊齊哈爾 161006）

乳房炎是危害世界奶牛業(yè)的主要因素之一。據(jù)報(bào)道，全世界約有2.2億頭奶牛，其中有1/3的奶?；加腥榉垦祝?］，臨床型乳房炎發(fā)病率僅2%～3%，而絕大部分是更為普遍的隱性乳房炎［2］。隱性乳房炎因無(wú)明顯的臨床癥狀，常不易被發(fā)現(xiàn)和重視。隱性乳房炎使泌乳奶牛每年的產(chǎn)奶量下降10%以上［3］，而且降低了牛奶品質(zhì)，縮短了奶牛使用壽命，增加了后備奶牛的成本、額外勞力費(fèi)用、藥物開(kāi)支和獸醫(yī)服務(wù)費(fèi)用，還延長(zhǎng)產(chǎn)后發(fā)情和妊娠時(shí)間，給養(yǎng)殖戶帶來(lái)了重大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，該病是當(dāng)前畜牧獸醫(yī)科技工作者一直關(guān)注的重點(diǎn)和研究的熱點(diǎn)，尤其是隱性乳房炎病因復(fù)雜、隱蔽性強(qiáng)、不易被發(fā)現(xiàn)，更是棘手的難題。近年來(lái)，由于我國(guó)中草藥資源豐富，且不易產(chǎn)生耐藥性，毒副作用極小，還具有促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)、增強(qiáng)免疫功能及提高機(jī)體抗病能力等特點(diǎn)，已成為研究熱點(diǎn)。因此，筆者用純中藥制劑乳康健進(jìn)行了治療奶牛隱性乳房炎的效力試驗(yàn)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

某奶牛場(chǎng)經(jīng)檢測(cè)患有隱性奶牛乳房炎的奶牛。

1.2 飼料

TMR全混日糧。

1.3 藥物

乳康健：將蒲公英、金銀花、連翹、秦皮等藥物精選，去雜質(zhì)，干燥。采用粉碎機(jī)將原料藥物加工成均勻的粉末，過(guò)篩，細(xì)度34～60目。確保加工制成的散劑干燥、疏松、色澤一致。按250 g/袋用塑料袋包裝，用量為每頭牛每天 1～2 袋，連用 7～10 d。

1.4 試劑與儀器

CMT 診斷液（SDS 7.5～12.5 g，NaOH 3.75 g，溴甲酚紫0.025 g，制成250 mL的溶液）；培養(yǎng)基：普通瓊脂培養(yǎng)基，血瓊脂培養(yǎng)基，伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，血清肉湯。95%酒精，革蘭氏染液，生理鹽水。

儀器：pH計(jì)，比重計(jì)，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，組織離心機(jī)，顯微鏡等。

2 方法

2.1 乳樣的采集

無(wú)菌采集陽(yáng)性奶牛的乳樣，采樣前先用溫水清洗，然后用75%酒精棉球消毒乳區(qū)，棄去前三把乳汁，然后人工擠出乳樣約10 mL置于滅菌青霉素小瓶中，4℃保存，2 h內(nèi)接種培養(yǎng)。

2.2 乳汁pH值測(cè)定

pH計(jì)測(cè)定。

2.3 乳汁比重測(cè)定

將乳樣倒入100 mL量筒中，置于平臺(tái)上。將比重計(jì)輕輕放入量筒中，注意避免乳樣溢出且比重計(jì)勿觸及量筒壁。待其浮起而穩(wěn)定不動(dòng)，且液面無(wú)氣泡時(shí)，然后視線保持和液面水平進(jìn)行觀察，讀取與液面接觸處的彎月面下緣最低點(diǎn)處的刻度值。

2.4 乳汁中氯化物含量測(cè)定

稱取AgNO34.3 g，加適量無(wú)氯離子的蒸餾水，攪拌使其溶解，以250 m L容量瓶定容，充分搖勻，置于暗處備用。取被檢乳樣2.00 mL，放入錐形瓶中，加入K2CrO4指示劑1 mL，在劇烈搖動(dòng)下用AgNO3標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至出現(xiàn)磚紅色，并經(jīng)搖動(dòng)后磚紅色仍不消失時(shí)為終點(diǎn)。記錄所消耗標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，計(jì)算試樣中氯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.5 細(xì)菌鑒定

2.5.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 將乳樣接種到普通瓊脂和鮮血瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后取出觀察，根據(jù)菌落的形態(tài)、大小、顏色等將菌落大致分類，然后根據(jù)細(xì)菌的形態(tài)、革蘭氏染色特點(diǎn)仔細(xì)分類，排除環(huán)境中常在的無(wú)致病性細(xì)菌。將挑選出來(lái)的細(xì)菌做進(jìn)一步純培養(yǎng)，培養(yǎng)方法同上，鏈球菌用鮮血瓊脂進(jìn)行培養(yǎng)。純培養(yǎng)后鏡檢無(wú)雜菌者保存于試管斜面培養(yǎng)基內(nèi)。

2.5.2 葡萄球菌的分離培養(yǎng) 經(jīng)無(wú)菌操作，分別進(jìn)行直接分離培養(yǎng)（普通瓊脂平板、普通瓊脂血平板)和選擇性分離培養(yǎng)（高鹽甘露醇瓊脂）。置37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)和溶血現(xiàn)象。對(duì)可疑單個(gè)菌落涂片、染色、鏡檢，進(jìn)一步觀察其在鑒別培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況，并純化培養(yǎng)可疑菌落，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5.3 葡萄球菌的鑒定 取已純培養(yǎng)的菌種，分別接種血瓊脂平板、普通瓊脂平板、甘露醇、蕈糖等生化培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18～24 h，置室溫24 h，觀察生長(zhǎng)表現(xiàn)、溶血情況和色素變化；同時(shí)接種普通肉湯，37℃培養(yǎng)18～24 h后進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn)。

2.6 隱性乳房炎檢測(cè)

用溫水將乳房擦洗干凈，后用0.2%新潔爾滅擦洗乳房，再用75%的酒精溶液消毒乳頭，然后戴上滅菌手套進(jìn)行人工擠乳，棄去前兩把乳，將4個(gè)乳區(qū)的乳樣擠到相應(yīng)的乳汁檢驗(yàn)盤(pán)中，傾斜檢驗(yàn)盤(pán)60°，此時(shí)檢驗(yàn)盤(pán)內(nèi)剩余2 mL左右的乳汁，加入2 mL CMT診斷液，立即水平搖動(dòng)檢驗(yàn)盤(pán)，使乳汁與試劑充分混合，10 s后觀察，判定標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表 1。

表1 CMT法判定標(biāo)準(zhǔn)

2.7 乳康健對(duì)患牛乳汁中體細(xì)胞數(shù)的影響和隱性奶牛乳房炎的治療作用

選取經(jīng)CMT法測(cè)定為強(qiáng)陽(yáng)性奶牛20頭，分為2組，第1組為乳康健治療I組（7頭），供給量500 g/頭，每天1次，連用7 d；第2組為乳康健治療II組（7頭），供給量250 g/頭，每天1次，連用7 d；第3組為空白對(duì)照組（6頭），正常飼喂，不給藥。各組于試前用CMT法測(cè)定患牛乳汁中體細(xì)胞數(shù)，并于給藥7 d后分別再用CMT法測(cè)定體細(xì)胞數(shù)，觀察其變化。

表2和表3試驗(yàn)結(jié)果表明，不同劑量的藥物給奶牛應(yīng)用7 d后，奶牛陽(yáng)性乳區(qū)均出現(xiàn)不同程度的轉(zhuǎn)陰，乳區(qū)陽(yáng)性率降低，但差異不顯著（P＞0.05）。表明乳康健對(duì)隱性乳房炎有良好的治療作用。

表2 乳康健對(duì)乳汁中體細(xì)胞數(shù)的影響

表3 乳康健對(duì)奶牛乳區(qū)陽(yáng)性率的影響

3 結(jié)果與分析

3.1 pH值測(cè)定結(jié)果

測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 pH值測(cè)定結(jié)果

3.2 乳汁比重測(cè)定結(jié)果

測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 乳汁比重

3.3 乳汁中氯化物含量測(cè)定

結(jié)果見(jiàn)圖3。

3.4 細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果

3.4.1 病原菌的種類 在75個(gè)隱性乳房炎乳區(qū)中選取60個(gè)陽(yáng)性反應(yīng)（++）乳區(qū)，通過(guò)初步細(xì)菌分離試驗(yàn)結(jié)合顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)，奶牛乳房炎主要致病菌有葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及一些雜菌。

3.4.2 革蘭氏染色葡萄球菌檢測(cè)結(jié)果 結(jié)果見(jiàn)表4。

3.4.3 革蘭氏染色鏈球菌檢測(cè) 結(jié)果見(jiàn)表5。

表4 60個(gè)陽(yáng)性乳區(qū)葡萄球菌檢測(cè)結(jié)果

表5 60個(gè)陽(yáng)性乳區(qū)鏈球菌檢測(cè)結(jié)果

3.5 乳康健治療結(jié)果

表6結(jié)果表明，用乳康健治療奶牛隱性乳房炎后其乳汁中鏈球菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的陽(yáng)性乳區(qū)數(shù)明顯下降，其中鏈球菌陽(yáng)性乳區(qū)數(shù)下降最明顯，治療有效率最高，達(dá)87.5%，其次是大腸桿菌。

表6 乳康健治療前后奶牛乳汁中細(xì)菌消長(zhǎng)情況

4 討論

1）普查結(jié)果顯示，本地區(qū)隱性乳房炎平均頭陽(yáng)性率53.1%；據(jù)報(bào)道，患隱性乳房炎乳區(qū)泌乳量可降低10%～15%［4］，乳汁中體細(xì)胞數(shù)越高，泌乳量減少得越多。

2）乳康健對(duì)奶牛隱性乳房炎的治愈率90%以上，而且療程很短，用藥5～7次就能基本痊愈，療程6～8 d，平均6.5 d，優(yōu)于臨床常用的青、鏈霉素。該藥不僅可提高泌乳量，而且還可降低乳汁中體細(xì)胞數(shù)，改善乳汁質(zhì)量，證明其對(duì)奶牛隱性乳房炎有防治作用。

［1］李會(huì)，孫志文，湯樹(shù)生，等.復(fù)方阿莫西林乳房注入劑治療臨床型奶牛乳房炎的療效觀察［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2012（3）：71-74.

［2］高桂生，高光平，史秋梅，等.復(fù)方中藥制劑“增乳健牛散”對(duì)奶牛隱性乳房炎主要病原菌的藥敏試驗(yàn)［J］.畜牧與飼料科學(xué),2012（2）:8-9.

［3］Katja K，F(xiàn)iona C，F(xiàn)lynn J，et a1.Intramammary-infusion of alive culture of lactococcus lactis for treatment of bovine mastitis：comparison with antibiotic treatment in field trials［J］.Dairy Research，2008，75：365-373.

［4］Muzaffar H，Christof V E.Cap gene as novel target for specific identification of staphylococcus aureus［J］.Clini Microbio，2008，46（2）：470-476.