蔣永祥 吳新華 盧奕

白內(nèi)障術后后囊膜混濁(posterior capsule opacification，PCO)的發(fā)生機制是術后由于炎性反應和血-房水屏障破壞，在大量分泌的細胞外基質(zhì)及各種細胞因子的參與下，殘余晶狀體上皮細胞(lens epithelial cell,LEC)在后囊膜上增殖、遷移及上皮-間質(zhì)轉化[1-2]。因此，抑制LEC增殖是預防PCO發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。白內(nèi)障LEC中的端粒酶活性和端粒長度明顯大于正常組,而晶狀體摘除術后PCO模型中，赤道部囊膜組織、后囊膜LEC中均可檢測到端粒酶活性[3-4]。抑制端粒酶活性可達到抑制細胞增殖及誘導細胞凋亡的目的。RNA干擾(RNA interference,RNAi)通過人為引入與內(nèi)源靶基因具有相同序列的小雙鏈RNA，誘導內(nèi)源性靶基因降解，達到阻止基因表達的目的，是一項快速、高效、便于操作的使靶基因失活技術[5]。本研究通過端粒酶反轉錄酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)RNAi技術抑制LEC TERT，達到抑制LEC增殖的目的，以期為進一步抑制白內(nèi)障術后PCO提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人LEC株(SRA 01/04)購自美國ATCC公司。視網(wǎng)膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelial cell,RPEC)由本實驗室制備。TERT小分子干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)、陰性對照siRNA及轉染試劑盒為美國Ambion公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 TERT siRNA的設計和合成 根據(jù)基因庫中TERT mRNA序列(NM003219)，設計和合成針對TERT顯性失活突變體區(qū)的siRNA。序列如下,正義鏈:5′-CAAGGUGGAUGUGACGGGCTT-3′，反義鏈: 3′-TTGUUCCACCUACACUGCCCG-5′。經(jīng)基因庫檢索，與TERT以外的基因序列無同源性。

1.2.2 LEC和RPEC TERT mRNA表達的檢測 將LEC 和RPEC放入含15%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、80萬U/L青霉素及1 g/L鏈霉素的達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)液(Dulbecco’s modified Eagle’s medium,DMEM)中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞生長匯合后按1∶2傳代，將對數(shù)生長期的細胞以4×105細胞/孔的濃度接種于六孔板內(nèi)，采用半定量反轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcriptional polymerase chain reaction,RT-PCR)法，提取每處理孔細胞總RNA。TERT引物：5′-GCCAGAACGTTCCGCAGAGAAAA-3′，5′-AATCATCCACCAAACGCAGGAGC-3′。反應條件為94 ℃ 20 s、48 ℃ 30 s 、72 ℃ 30 s，30個循環(huán)。設立空白陰性對照組，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參照。取PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳，紫外線照相并掃描分析。

1.2.3 TERT siRNA對LEC內(nèi)源性TERT表達的影響 取培養(yǎng)的LEC，以4×105細胞/孔的濃度接種于六孔板內(nèi)，加入不含抗生素的DMEM(含15%胎牛血清)2 mL進行培養(yǎng)，以便轉染時細胞達到90%～95%匯合。按LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉染試劑盒說明調(diào)整TERT siRNA至終濃度為50 nmol/L，加入細胞；繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收獲細胞,抽提細胞總RNA，反轉錄，實時PCR檢測TERT基因表達的變化。

1.2.4 TERT siRNA對轉染LEC和RPEC增殖抑制作用的觀察 取培養(yǎng)的LEC和RPEC，以4×105細胞/孔的濃度接種于六孔板內(nèi)，加入不含抗生素的DMEM(含15%胎牛血清)2 mL進行培養(yǎng)；調(diào)整TERT siRNA至終濃度為50 nmol/L，加入細胞;48 h后，消化細胞1/3傳代；60 h，再次使用TERT siRNA(終濃度為50 nmol/L)轉染細胞；96 h，細胞計數(shù)試劑盒8(cell counting kit-8,CCK-8)檢測細胞增殖能力的變化；按楊晉等[6]介紹的方法檢測LEC和RPEC的細胞活性，每組細胞做4組平行樣。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均值±標準差表示。采用成組設計t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

半定量RT-PCR檢測LEC和RPEC內(nèi)源性TERT mRNA的表達，結果顯示RPEC中檢測不到TERT的表達，LEC中可檢測到低水平的TERT表達(圖1)。

圖1. LEC和RPE中內(nèi)源性TERT mRNA的表達

TERT siRNA處理LEC 48 h后，實時PCR檢測TERT基因表達的變化：LEC對照組TERT mRNA相對表達水平為1.00±0.03，LEC siRNA組TERT mRNA相對表達水平為0.20±0.01，兩組相比差異有統(tǒng)計學意義(t=-38.40，P<0.05)。

TERT siRNA處理LEC、RPEC 96 h后，CCK-8檢測2種細胞的增殖抑制情況顯示：LEC對照組活性為0.79±0.02，LEC siRNA組為0.55±0.04，兩組差異有統(tǒng)計學意義(t=7.18，P<0.05)；RPEC對照組活性為1.16±0.01，RPEC siRNA組為1.13±0.04,兩組差異無統(tǒng)計學意義(t=0.81，P>0.05)。

3 討論

染色體端粒DNA的長度是由端粒增長(端粒酶合成)和縮短(細胞分裂時DNA復制)的平衡來維持的，其中端粒酶活性對維持端粒長度及細胞長期生存有重要意義。端粒酶的激活使端粒長度不斷延長，細胞獲得無限增殖能力，可成為永生化細胞。因此，端粒酶的激活與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展或增殖活躍的組織細胞密切相關。端粒酶由端粒酶RNA成分、端粒酶相關蛋白1和TERT三部分組成。端粒酶RNA成分、端粒酶相關蛋白1在許多缺乏端粒酶活性的正常組織中表達，與端粒酶表達無相關性。TERT是端粒酶的催化亞單位，是決定端粒酶活性的限速決定因子，與端粒酶表達呈一致性[7]。TERT mRNA只在惡性腫瘤組織或腫瘤細胞株以及某些有高度再生潛力的自我更新組織中表達。

在既往我們的實驗中，建立兔PCO模型，取赤道部囊膜組織、混濁后囊膜，檢測兩者LEC端粒酶活性，發(fā)現(xiàn)兔晶狀體赤道部囊膜組織、后囊膜均可檢測到端粒酶活性，兔PCO模型LEC中端粒酶活性較赤道部囊膜LEC低[4]。

RNAi技術主要是通過siRNA來執(zhí)行其阻斷體內(nèi)特定基因表達的功能，siRNA在細胞內(nèi)與靶基因特異性結合并使之降解。目前合成siRNA分子有化學合成、體外轉錄等體外合成法以及以質(zhì)?；虿《绢愝d體介導的體內(nèi)表達法。

LEC中可檢測到低水平的TERT表達，本實驗通過體外合成TERT siRNA干擾TERT基因，抑制人LEC端粒酶活性。結果顯示：轉染TERT siRNA的LEC，其TERT mRNA相對表達水平明顯下降，提示TERT siRNA抑制了其端粒酶活性。同時，細胞增殖實驗結果表明，TERT siRNA處理96 h后的LEC，CCK-8檢測其增殖活性明顯抑制?？梢?，TERT siRNA在抑制端粒酶活性的同時也抑制了細胞增殖。

在正常體細胞中，除生殖細胞和造血干細胞等極少數(shù)細胞外，均檢測不到端粒酶活性。已有研究[8]證明，眼內(nèi)晶狀體纖維細胞、角膜上皮細胞、內(nèi)皮細胞和睫狀體無色素細胞中未發(fā)現(xiàn)端粒酶表達。我們的實驗也證實RPEC中未檢測到TERT表達。轉染TERT siRNA 96 h后，RPEC的增殖活性也未受到影響。

因此，抑制LEC端粒酶活性，可有效抑制LEC的增殖，對眼內(nèi)其他組織細胞影響較小，這可能是抑制白內(nèi)障術后后囊膜混濁一個較有前途的治療方法。

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[2]黎曉新.眼科學新進展[M].北京：中華醫(yī)學電子音像出版社,2009:123-127.

[3]黃文麗，蔣永祥，呂志剛.兔晶狀體超聲乳化后囊膜混濁模型的建立與觀察[J] .中國眼耳鼻喉科雜志,2011,1(1)：13-14.

[4]呂志剛,黃文麗,蔣永祥,等.端粒酶活性在兔后囊膜混濁晶狀體上皮細胞中的表達及意義[J].中華眼科雜志,2008,44(10):902-905.

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[6]楊晉,盧奕,郭禮和,等.慢病毒介導的單純皰疹病毒胸苷激酶基因/丙氧鳥苷體系抑制人晶狀體上皮細胞的研究[J].中華眼科雜志,2007,43(9):810-816.

[7]Morin GB.The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats[J]．Cell，1989，59(3)：521-529.

[8]Colitz CM，Davidson MG，McGAHAN MC．Telomerase activity in lens epithelial cells of normal and catamctous lenses[J]．Exe Eye Res，1999，69(6)：641-649.