張厚森* 武曉靜 王 瑋 方文娟

（江蘇省理化測(cè)試中心，江蘇省營(yíng)養(yǎng)成分與有毒有害物質(zhì)檢測(cè)中心，南京 210042）

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豬肉中磺胺多辛的不確定度評(píng)定

張厚森* 武曉靜 王 瑋 方文娟

（江蘇省理化測(cè)試中心，江蘇省營(yíng)養(yǎng)成分與有毒有害物質(zhì)檢測(cè)中心，南京 210042）

對(duì)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豬肉中磺胺多辛含量過程中引入的不確定度進(jìn)行了分析和評(píng)定，通過試驗(yàn)計(jì)算出豬肉中磺胺多辛含量測(cè)量結(jié)果的不確定度。在置信水平為95%，包含因子k=2時(shí)，其相對(duì)擴(kuò)展不確定度8.58%；當(dāng)磺胺多辛含量為35.37 μg/kg，其擴(kuò)展不確定度為3.03 μg/kg。樣品的前處理所引入的不確定度對(duì)合成不確定度的貢獻(xiàn)最大。

不確定度；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；磺胺多辛；豬肉

磺胺多辛（Sulfadoxine） 又名周效磺胺，磺胺鄰二甲氧嘧啶，是一種應(yīng)用較廣的磺胺類藥物（Sulfonamides，SAs）。磺胺多辛屬長(zhǎng)效磺胺類藥物，具廣譜抗菌作用，作為一種化學(xué)抗菌消炎藥物其主要用于預(yù)防和治療細(xì)菌感染性疾病?；前范嘈翆?duì)畜禽疾病控制和治療起到重要作用，但是磺胺類藥物存在著嚴(yán)重的副作用，人體中長(zhǎng)期存在磺胺類藥物會(huì)導(dǎo)致許多細(xì)菌對(duì)其產(chǎn)生耐藥性，且具有潛在的致癌性。當(dāng)前，國(guó)家逐漸加大了對(duì)畜禽產(chǎn)品中獸藥殘留的監(jiān)管力度，我國(guó)農(nóng)業(yè)部第235號(hào)文件規(guī)定在動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物的總殘留限量為100 μg/kg。

目前液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS） 已經(jīng)廣泛應(yīng)用于磺胺類獸藥殘留方面的檢測(cè)。筆者參照國(guó)家計(jì)量技術(shù)規(guī)范《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》和GB/T 21316-2007的要求，對(duì)高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豬肉中磺胺多辛的不確定度進(jìn)行了分析與評(píng)定。

1 試驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（LC-MS/MS）配有ESI源，型號(hào)Agilent1260-6430；氮吹裝置，天津奧特賽因斯儀器有限公司；色譜柱為Agilent ZORBAXSBC18柱（2.1mm*50mm，1.8μm）；0.22μm水相濾膜，天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

磺胺多辛，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；豬肉，客戶提供；化學(xué)試劑均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)；甲醇、乙腈均為色譜純，美國(guó)TEDIA公司。

1.2 液相色譜與質(zhì)譜條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX SB C18柱（2.1 mm*50 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸-乙腈（體積比為7∶3）；流速0.20 mL/min；柱溫35℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜離子源為電噴霧正離子模式（ESI+），噴霧器壓力15.0 Psi；質(zhì)譜掃描采集方法為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；脫溶劑氣為氮?dú)?，溫?50℃，流量12 L/min；碰撞氣為高純氮?dú)?；毛?xì)管電壓4000V。

1.3 測(cè)試方法

精密稱取2 g經(jīng)絞肉機(jī)處理均勻的豬肉樣品于50 mL的塑料離心管中，加入15 g經(jīng)干燥過的無(wú)水硫酸鈉和20 mL分析純的乙腈溶液，用勻漿機(jī)以8 000 r/min均漿提取2 min，以4 000 r/min離心3 min，上清液轉(zhuǎn)入濃縮燒瓶中，殘?jiān)俜謩e用15 mL的乙腈按以上步驟重復(fù)提取兩次，合并提取液后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器于40℃水浴減壓蒸干，準(zhǔn)確加入1 mL流動(dòng)相溶液和1 mL用上述溶液飽和過的正己烷震蕩并超聲5 min溶解殘?jiān)?。將以上溶液轉(zhuǎn)移至5 mL具塞聚乙烯塑料離心管中，漩渦1 min，以3 000 r/min離心3 min，棄去上層正己烷，再加入1mL上述正己烷重復(fù)以上步驟至下層水相變?yōu)橥该饕后w，將下層清液過0.22 μm的濾膜，設(shè)定進(jìn)樣量10 μL后用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

用相應(yīng)的空白樣品提取液配制一系列的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液，使其質(zhì)量濃度分別為5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L、40 μg/L、100 μg/L 和 200 μg/L，待上機(jī)測(cè)試，以色譜峰面積對(duì)質(zhì)量濃度作線性回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線用以定量。

1.4 評(píng)定數(shù)學(xué)模型

磺胺多辛含量計(jì)算公式：

式中：X—樣品中磺胺多辛含量，μg/kg；

ρ—經(jīng)處理待上機(jī)樣品溶液中磺胺多辛的質(zhì)量濃度，μg/L；

V—待上機(jī)樣品溶液的體積，mL；

m—試樣質(zhì)量，g；

fR—磺胺多辛的回收率校正系數(shù)。

2 不確定度的主要組成部分

本試驗(yàn)涉及到的對(duì)測(cè)試結(jié)果有直接影響的儀器有天平和液質(zhì)聯(lián)用儀，在測(cè)試過程中所用到的量具和實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境溫度對(duì)結(jié)果也有一定的影響，樣品的前處理，測(cè)試過程的隨機(jī)效應(yīng)以及標(biāo)準(zhǔn)曲線建立的過程對(duì)測(cè)試結(jié)果的不確定度也有較大的影響?？蓪⒁陨喜淮_定度的來(lái)源歸屬于以下幾個(gè)方面：

a）樣品稱量操作引入的不確定度；

b）定容過程中體積引入的不確定度；

c） 液質(zhì)聯(lián)用儀儀器本身所引入的不確定度，包括儀器自帶的進(jìn)樣針、工作站自動(dòng)積分器、儀器的穩(wěn)定性等，主要由儀器的校準(zhǔn)證書來(lái)確定；

d）樣品前處理過程引入的不確定度，主要包含萃取、濃縮和純化等步驟，其中每一個(gè)操作步驟都會(huì)引入不確定度，其不確定度因素較多。此不確定度可通過對(duì)標(biāo)準(zhǔn)添加量的回收率測(cè)定進(jìn)行判定；

e） 測(cè)試過程的隨機(jī)效應(yīng)所引入的不確定度，可通過對(duì)同一個(gè)樣品重復(fù)平行測(cè)定后的結(jié)果進(jìn)行計(jì)算和評(píng)定；

f）標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程引入的不確定度。

3 不確定度的評(píng)定

3.1 樣品稱樣量引入的不確定度

3.2 測(cè)試過程中由定容體積所帶入的不確定度

合并以上兩部分所引入的不確定度，得到由體積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.3 液質(zhì)聯(lián)用儀儀器檢測(cè)時(shí)引入的不確定度

根據(jù)校準(zhǔn)證書提供：U=3%，k=2，則儀器引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：Urel（E）=3%/2=0.015 0。

3.4 樣品前處理引入的不確定度

由于目標(biāo)物質(zhì)磺胺多辛不可能從樣品基質(zhì)中完全提取出來(lái)，加上濃縮和純化過程的損失導(dǎo)致了前處理過程的不確定度較大，樣品前處理過程產(chǎn)生的不確定度應(yīng)用在空白豬肉樣品中添加目標(biāo)物磺胺多辛后計(jì)算其回收率的方式來(lái)進(jìn)行評(píng)定，對(duì)6次添加質(zhì)量濃度均為70 g/L的最終上機(jī)液進(jìn)行測(cè)定，其回收率分別為：90.5%、96.2%、88.7%、89.2%、92.7%和87.5%，則目標(biāo)組分磺胺多辛的平均回收率（R） 為90.8%，其標(biāo)準(zhǔn)偏差（S） 為3.18%，則由樣品前處理引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為U（R） =S=0.031 8；Urel（R）=U（R）/R=0.035 0。

3.5 測(cè)試過程隨機(jī)效應(yīng)引入的不確定度

對(duì)同個(gè)一樣品按照方法的要求重復(fù)進(jìn)行10次平行有效試驗(yàn)測(cè)定, 對(duì)樣品的均勻性、試劑的濃度和純度、天平的重復(fù)性、容量瓶移液槍等體積刻度的重復(fù)性等因素引入的不確定度進(jìn)行計(jì)算和評(píng)定。經(jīng)測(cè)試后樣品中磺胺多辛的含量分別為：34.25 μg/kg、36.38 μg/kg、33.52 μg/kg、36.85 μg/kg、 37.05 μg/kg、 34.52 μg/kg、35.57 μg/kg、 36.92 μg/kg、 33.09 μg/kg、35.52μg/kg，10次測(cè)定的平均值為：w=35.37μg/kg，根據(jù)貝塞爾公式計(jì)算所得10次試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差為：1.456 6 μg/kg，則A類標(biāo)準(zhǔn)不確定度為U（w）=1.456 6/=0.467 4；A類相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為Urel（w）=U（w）/w=0.467 4/35.37=0.013 2。

3.6 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程引入的不確定度

在本試驗(yàn)中首先需要配制一個(gè)質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的磺胺多辛儲(chǔ)備溶液，將此溶液稀釋成質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，再將其適當(dāng)稀釋后配置成一系列質(zhì)量濃度為 5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L、40 μg/L、100 μg/L 和 200 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液來(lái)對(duì)樣品中的目標(biāo)物進(jìn)行定量，在標(biāo)準(zhǔn)溶液配制的過程中會(huì)引入較多的不確定度。

故在配制磺胺多辛標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的操作過程中所帶入的綜合相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度可計(jì)算為：

在配制質(zhì)量濃度為1 ug/mL磺胺多辛標(biāo)液的過程中所引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

質(zhì)量濃度為5μg/L、10μg/L、20μg/L、40μg/L、100 μg/L和200 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制方法是：用1 mL移液器吸各取1 mL質(zhì)量濃度為1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液于體積分別為200 mL、100 mL、50 mL、25 mL、10 mL和5 mL的A級(jí)容量瓶中，并用乙腈定容至刻度。以上6只容量瓶的容量允差分別為0.15 mL、0.10 mL、0.05 mL、0.03 mL、0.02 mL 和0.02mL，按照上述計(jì)算和評(píng)定方法，可計(jì)算出各個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：0.00 582、0.00 583、0.00 583、0.00 584、0.00 591和0.00 624。綜合判定時(shí)采用由質(zhì)量濃度梯度為200 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液所引入最大相對(duì)不確定度值0.00624，故本步操作的相對(duì)不確定度為Urel（S4）=0.0062。

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中溫度的變化會(huì)引入不確定度，乙腈體積膨脹系數(shù)為1.37×10-3/℃，實(shí)驗(yàn)室的溫度為20℃，變化范圍為5℃，由溫度波動(dòng)引起的10 mL容量瓶中乙腈溶液的體積偏差為10 mL×5℃×1.37×10-3/℃=0.0 685 mL，采用矩形分布進(jìn)行分析和判定，則由實(shí)驗(yàn)室的溫度波動(dòng)所引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：U（T1）=0.0685/=0.0395mL；其相對(duì)不確定度可計(jì)算為：Urel（T1）=0.0 395/10=0.0 040。標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中依次用到了10 mL、1 L和200 mL（選取在最后一步配制過程中引入不確定度最大的一只容量瓶進(jìn)行計(jì)算）3種容量瓶，其相對(duì)不確定度均為0.0040。則因溫度效應(yīng)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.7 合成不確定度和擴(kuò)展不確定度及測(cè)量結(jié)果的報(bào)告

相對(duì)擴(kuò)展不確定度可由合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以包含因子求得，在95%置信水平下，k=2時(shí)，其相對(duì)擴(kuò)展不確定度為：

U=k×Urel×100%=8.58%。

由試驗(yàn)計(jì)算得試樣中磺胺多辛含量為35.37μg/kg，其擴(kuò)展不確定度為：

U擴(kuò)=ρU=35.37μg/kg×0.0858=3.03μg/kg。

磺胺多辛含量測(cè)定結(jié)果表示為：

w=（35.37±3.03）μg/kg，k=2。

4 結(jié)語(yǔ)

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豬肉中磺胺多辛的測(cè)試步驟比較復(fù)雜，測(cè)試中的不確定因素較多。從各個(gè)不確定度分量的評(píng)估結(jié)果來(lái)看，樣品的前處理、液質(zhì)聯(lián)用儀的工作狀況和測(cè)試過程的隨機(jī)效應(yīng)所引入的不確定度對(duì)合成不確定度的貢獻(xiàn)較大。檢測(cè)人員應(yīng)充分了解影響測(cè)定結(jié)果不確定度的因素，對(duì)關(guān)鍵測(cè)試環(huán)節(jié)要引起重視，盡可能的減少各種影響檢測(cè)結(jié)果不確定度的因素。在樣品測(cè)試時(shí)尤其是前處理過程中要嚴(yán)格按照方法的要求進(jìn)行規(guī)范操作，以減少由于樣品處理和測(cè)試過程的隨機(jī)效應(yīng)所引入的不確定度，檢測(cè)人員還應(yīng)對(duì)測(cè)試儀器進(jìn)行定期檢查維護(hù)以確保儀器正常穩(wěn)定的運(yùn)轉(zhuǎn)。

［1］ 中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院.JJF 1059-1999測(cè)量不確定度評(píng)定與表示［S］.北京：中國(guó)計(jì)量出版社，1999：1-27.

［2］ 中華人民共和國(guó)山東出入境檢驗(yàn)檢疫局，中華人民共和國(guó)吉林出入境檢疫局，中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院.GB/T 21316-2007動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物殘留量的測(cè)定液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008：1-17.

［3］ 中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院.JJG 646-2006移液器檢定規(guī)程［S］.北京：中國(guó)計(jì)量出版社，2007：1-13.

［4］ 中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院.JJG 700-1999微量注射器的標(biāo)準(zhǔn)［S］.北京：中國(guó)計(jì)量出版社，1999：1 536-1 537.

［5］ 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心.GB 12806-1991實(shí)驗(yàn)室玻璃儀器單標(biāo)線容量瓶［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2001：1-12.

Evaluation of uncertainty of sulfadoxine in pork by liquid chromatography tandem mass spectrometry

ZHANG Hou-sen*WU Xiao-jingWANG WeiFANG Wen-juan
（Jiangsu province physics and chemistry testing center，Jiangsu province nutrients and toxic testing center，Nanjing 210042，China）

Uncertainties from the test results of sulfadoxine in pork by liquid chromatography tandem mass spectrometry were analyzed and assessed.The relative expended uncertainty calculated from the experimental date was 8.58%，when the designed incredible probability was 95%（k=2）.The expended uncertainty was 3.03 g/kg，while the content of sulfadoxine in the sample was 35.37 g/kg.The contribution of the uncertainty introduced by the sample pretreatment was the largest part to the combined uncertainty.

uncertainty；liquid chromatography tandem mass spectrometry；sulfadoxine；pork

TS207.5+1

A

1673-6004（2012）03-0055-04

*張厚森，男，1978年出生，2005年畢業(yè)于江蘇大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工工程專業(yè)，工程師

2012-07-01

2012-07-08