張小華，陳力學(xué)，賈毅敏△

(1 重慶市腫瘤研究所藥劑科 400030;2 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究中心 400016)

在新藥和口服藥物制劑的處方前研究中，有必要對(duì)藥物在口服后體內(nèi)的吸收情況進(jìn)行預(yù)測(cè)。小腸是口服藥物被吸收的主要器官，探討在小腸中藥物的吸收過(guò)程，可以為藥物新劑型的研發(fā)提供依據(jù)[1]。本研究采用大鼠單向灌流模型，探討鹽酸普萘洛爾(propranolol hydrochloride，PNH)的腸吸收情況，為鹽酸普萘洛爾制劑合理選擇處方和臨床藥代動(dòng)力學(xué)與藥效學(xué)的深入研究奠定基礎(chǔ)。為了避免單向灌流法“標(biāo)示物”給測(cè)定帶來(lái)的影響，本實(shí)驗(yàn)引入了一種相對(duì)簡(jiǎn)單的重量法(gravimetric method)來(lái)標(biāo)示灌流液體積[2]。

1 材料與方法

1.1材料 清潔級(jí)健康成年雄性SD大鼠，體質(zhì)量(250±20)g，重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(渝) 2007-0001。PNH(純度99.9％，常州亞邦制藥有限公司，批號(hào)M060215)，烏拉坦(上海化學(xué)試劑廠產(chǎn)品，批號(hào)090612)，甲醇(色譜純，山東禹王試劑廠，批號(hào)20090306052)，其他試劑均為分析純。Krebs-Ringer緩沖液為灌流液[3]，其組成為：NaCl 133.5 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，CaCl23.3 mmol/L，NaH2PO42.67 mmol/L，MgCl20.21 mmol/L，NaHCO316.3 mmol/L，D-Glucose 7.8 mmol/L。供試液中PNH濃度為15 μg/mL。

1.2儀器 蠕動(dòng)泵BT00-100M(保定蘭格恒流泵有限公司)；高效液相色譜儀(LC-10AT VP，SHIMADZU，日本)；紫外檢測(cè)器(SPD-10A VP，SHIMADZU，日本)；色譜柱(C18柱，5 μm，150.0×4.6 mm，Dikma，日本)；電子分析天平(上海分析儀器廠)，HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省榮華儀器制造公司)，JA-1003 型電子分析天平(中國(guó)上海精科天平廠)。

1.3方法

1.3.1色譜系統(tǒng)的適用性實(shí)驗(yàn) 色譜方法如下，流動(dòng)相：甲醇0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液-三乙胺(48.0∶52.0∶0.5，V/V/V)；檢測(cè)波長(zhǎng)：290 nm；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。按此色譜條件進(jìn)行色譜分析，收集6 h后的空白腸灌流液，以此腸灌流液配制不同濃度的PNH標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱(chēng)取PNH對(duì)照品3.2 mg，純水溶解，置于25 mL容量瓶中，用K-R緩沖液定容，得PNH對(duì)照品儲(chǔ)備液。以?xún)?chǔ)備液配制濃度為1、2、4、6、8、10、15 μg/mL的對(duì)照品溶液，經(jīng)HPLC法測(cè)定。

1.3.3管路的物理吸附性考察 配制含PNH約15 μg/mL的循環(huán)液50 mL，連接好循環(huán)管路，考察120 min管路對(duì)PNH的吸附。于0、30、60、90、120 min取樣，照“1.3.1”項(xiàng)下方法測(cè)定。

1.3.4精密度 按“1.3.2”項(xiàng)下操作方法，制備3批濃度分別為2、10、15 μg/mL(每個(gè)濃度5份)的對(duì)照循環(huán)液，依“1.3.1”項(xiàng)方法測(cè)定，分別計(jì)算批內(nèi)、批間精密度。

1.3.5穩(wěn)定性考察 用空白腸灌流液配制15 μg/mL的PNH溶液3份,37 ℃水浴孵育6 h，分別于1、2、3、4、6 h取樣，進(jìn)行HPLC分析，比較放置前后峰面積。

1.3.6方法回收率的測(cè)定 精密稱(chēng)取干燥至恒重的PNH適量，用水溶解、定容至100 mL，精密吸取1.0 mL，用空白腸灌流液稀釋?zhuān)M(jìn)行HPLC分析，經(jīng)回歸方程求得濃度，計(jì)算回收率。使用低、中、高3種濃度的PNH溶液，考察在空白腸灌流液存在下藥物的回收率。

以上公式中：Qin和Qout分別為腸道進(jìn)出口灌流液的體積(mL)，假定進(jìn)出口灌流液密度為1.0g/mL；l和r分別為被灌流腸段的長(zhǎng)度(cm)和橫截面半徑(cm)，Q為灌流速度(-0.25mL/min)，t為灌流時(shí)間(～0.25h)；V為灌流腸段的體積，實(shí)驗(yàn)時(shí)間共105min。

1.3.8大鼠在體腸單向灌流法[4]實(shí)驗(yàn)前先用供試液對(duì)管路進(jìn)行循環(huán)飽和，以消除管路對(duì)藥物的吸附影響。實(shí)驗(yàn)時(shí)取自由飲水禁食12h的SD大鼠，腹腔注射20％烏拉坦注射液(1.0g/kg)。麻醉后，將大鼠固定，保持體溫，沿腹中線打開(kāi)腹腔，分別截取約10cm待考察腸段，于兩端剪切后插管，入口處的插管與蠕動(dòng)泵連接，結(jié)扎。將傷口用浸有生理鹽水的脫脂棉覆蓋保濕，并置于紅外燈下保溫。用37 ℃的生理鹽水將小腸內(nèi)容物沖洗干凈后，即在進(jìn)口處用已知質(zhì)量小瓶?jī)?nèi)裝有的供試液灌流，流速為0.25mL/min，每隔15min在出口處用另一已知質(zhì)量的小瓶收集灌流液，然后迅速更換下一組供試液小瓶和收集液小瓶，并稱(chēng)量置換出的供試液小瓶和收集液小瓶的質(zhì)量，105min后實(shí)驗(yàn)結(jié)束。將大鼠處死，剪下被灌流腸段，測(cè)量其長(zhǎng)度和內(nèi)徑。本研究分別選取十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸進(jìn)行考察，根據(jù)公式1和2計(jì)算藥物在不同腸段的吸收速率常數(shù)和表觀吸收系數(shù)。(1)濃度對(duì)腸吸收的影響：以十二指腸為例，分別配制了濃度為5、10、15μg/mL的PNH溶液，考察了不同濃度藥液對(duì)PNH的腸吸收情況。(2)pH值對(duì)藥物吸收的影響：以十二指腸為例，分別配制了pH值為5.4、6.8和7.4的藥液，考察了不同pH值藥液對(duì)PNH的腸吸收情況。

2 結(jié) 果

2.1系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 在本色譜條件下，空白腸灌流液不干擾PNH的測(cè)定，藥物的保留時(shí)間約為4.5min,見(jiàn)圖1。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 在1～15μg/mL濃度范圍PNH液的濃度(C)與色譜峰面積(A)呈良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為C=25 960A+8 735.1(r=0.999 4，n =7)，見(jiàn)圖2。

2.3管路的物理吸附性考察 管路對(duì)PNH無(wú)吸附作用,見(jiàn)表1。

a：空白腸液；b：藥物在空白腸液中的色譜圖；c：藥物在體腸吸收試驗(yàn)中的色譜圖。

圖2 PNH在腸灌流液中的標(biāo)準(zhǔn)曲線(n=7)

表1器械物理吸附考察結(jié)果

時(shí)間(min)0306090120A(C=15μg/mL)367543347926376364357519367467

精密度=3.4％。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=15)

2.4精密度 低(2 μg/mL)、中(10 μg/mL)、高(15 μg/mL)3個(gè)濃度的批內(nèi)精密度分別為1.33％、1.46％和1.57％(n=5)，批間精密度分別為1.38％、1.79％和2.01％(n=3)。

2.5穩(wěn)定性試驗(yàn) PNH在Krebs-Ringer液中穩(wěn)定性良好，PNH在灌流液中6 h內(nèi)測(cè)定是穩(wěn)定的,見(jiàn)表2。

2.6方法回收率的測(cè)定 方法回收率符合要求，見(jiàn)表3。

2.7大鼠在體腸單向灌流法 通過(guò)大鼠各腸段部位藥物吸收的研究表明，各腸段對(duì)PNH均具有較大的表觀吸收系數(shù)和藥物吸收速率常數(shù)。各腸段與十二指腸段藥物吸收速率常數(shù)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；表觀吸收系數(shù)各腸段間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說(shuō)明PNH在全腸道吸收較好,見(jiàn)表4。

2.7.1濃度對(duì)腸吸收的影響 結(jié)果顯示PNH的濃度在考察范圍內(nèi)對(duì)Ka和Papp無(wú)明顯影響，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表明PNH在十二指腸段的吸收無(wú)自身濃度抑制作用，表明PNH主要以被動(dòng)擴(kuò)散機(jī)制吸收入體循環(huán)[5],見(jiàn)表5。

2.7.2pH值對(duì)藥物吸收的影響 數(shù)據(jù)說(shuō)明在考察范圍內(nèi)的不同pH值對(duì)Ka和Papp無(wú)明顯影響，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表6。

表4 PNH腸道不同部位吸收結(jié)果(n=5)

表5 不同濃度對(duì)PNH十二指腸吸收的影響

表6 不同pH對(duì)PNH十二指腸吸收的影響

3 討 論

3.1藥物試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷倪x擇 目前，以動(dòng)物試驗(yàn)?zāi)Ｐ驮u(píng)價(jià)藥物腸吸收的方法有離體法、在體法和體內(nèi)法等多種方法[6-11],本研究采用在體法模擬口服給藥后體內(nèi)吸收的腸道環(huán)境，以“單向灌流”的方式考察藥物在大鼠各個(gè)腸段的吸收情況。由于在體腸單向灌流實(shí)驗(yàn)中各腸段同時(shí)存在有水分吸收，因此引入重量法進(jìn)行灌流液的體積校正。與傳統(tǒng)的酚紅法比較，重量法通過(guò)比較試驗(yàn)后收集瓶和試驗(yàn)前供試液瓶的重量差異，直接真實(shí)地反映腸道水分吸收情況，而且本法只需測(cè)定被檢測(cè)藥物濃度，沒(méi)有灌流液“體積標(biāo)示物”的測(cè)定干擾。有研究表明，灌流液“體積標(biāo)示物”酚紅存在一定程度的腸吸收，可能干擾某些化合物的腸道轉(zhuǎn)運(yùn)或分析測(cè)定[12-13]。此外，本方法對(duì)分析檢測(cè)儀器的要求相對(duì)較低，藥物分析方法的建立相對(duì)簡(jiǎn)單易行，檢測(cè)時(shí)間縮短，檢測(cè)費(fèi)用降低。重量法也有一定的局限性。本實(shí)驗(yàn)設(shè)定灌流液密度為1 g/mL,由于在單向灌流試驗(yàn)中腸壁溶蝕或黏膜細(xì)胞脫落會(huì)增加灌流液黏度，改變其密度。因此在采用重量法研究大鼠單向灌流在體腸吸收情況時(shí)應(yīng)注意修正灌流液密度，盡量減小誤差。

3.2藥物吸收機(jī)制初步研究 本研究結(jié)果表明，PNH的濃度和pH值在考察范圍內(nèi)對(duì)藥物的腸吸收沒(méi)有影響，在考察濃度范圍內(nèi)，Ka值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，PNH的吸收機(jī)制為被動(dòng)擴(kuò)散。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，大鼠的表觀滲透系數(shù)Papp<0.03×10-4cm/s時(shí)，藥物難以吸收；Papp>0.2×10-4cm/s時(shí)，藥物易于吸收[6]。PNH在十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸中的Papp分別為3.05×10-4cm/s、2.15×10-4cm/s、1.98×10-4cm/s、2.08×10-4cm/s，提示PNH在十二指腸和小腸全腸段的吸收良好。

3.3對(duì)劑型設(shè)計(jì)的指導(dǎo)意義 本研究對(duì)大鼠在體腸吸收的研究結(jié)果，為PNH劑型設(shè)計(jì)提供了依據(jù)。該藥在全腸道吸收良好，為被動(dòng)吸收機(jī)制，根據(jù)高血壓治療中平穩(wěn)降壓的治療原則，考慮可將PNH制成緩釋制劑或以零級(jí)釋放速率為特征的控釋制劑，實(shí)現(xiàn)藥物的緩慢恒速釋放，可延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間，提高藥物治療效果。

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