張戰(zhàn)民，張曉華

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，南昌 330006)

Wnt信號(hào)通路是一個(gè)復(fù)雜的蛋白質(zhì)作用通路，其參與細(xì)胞的增殖、分化、代謝及凋亡，是細(xì)胞發(fā)育所必需的[1]，調(diào)節(jié)著細(xì)胞行為及細(xì)胞的相互作用，因此，此通路不僅在胚胎發(fā)育調(diào)控中起至關(guān)重要的作用，而且與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[2]。研究表明，Wnt信號(hào)通路與多種腫瘤的的生長(zhǎng)、復(fù)發(fā)和耐藥有著密切的關(guān)系[3-4]。本研究通過(guò)沉默Wnt1基因的表達(dá)，觀察乳腺癌細(xì)胞對(duì)多柔比星敏感性的變化，為尋找克服乳腺癌耐藥性的新靶點(diǎn)提供依據(jù),現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料 人乳腺癌MCF-7/ADR細(xì)胞株由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所提供，此細(xì)胞株的原代培養(yǎng)細(xì)胞供體均一，取材部位及組織類型穩(wěn)定，為已鑒定細(xì)胞；PRMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，四甲基偶氮唑鹽(MTT)、青霉素、鏈霉素、多柔比星為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，總RNA提取試劑盒采用美國(guó)Promega公司產(chǎn)品，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒為日本Takara公司生產(chǎn)，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，Wnt1 siRNA雙鏈干擾序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。

1.2方法

1.2.1MCF-7/ADR細(xì)胞在Wnt1基因沉默前后對(duì)多柔比星耐藥性的比較

1.2.1.1MCF-7/ADR細(xì)胞的培養(yǎng) 采用含10％胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 U/mL鏈霉素、RPMI 1640的完全培養(yǎng)基，在37 ℃、5％CO2的飽和濕度條件下培養(yǎng)，每2～3 d換液并傳代1次，采用0.02％乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2和0.25％胰蛋白酶的1∶1混合液進(jìn)行消化，且使多柔比星梯度誘導(dǎo)濃度最終維持在1 μg/mL。

1.2.1.2細(xì)胞總RNA的提取及光密度值的測(cè)定 培養(yǎng)出的MCF-7/ADR細(xì)胞每(1～5)×106個(gè)細(xì)胞加1 mL TRIzol試劑，吸管吹吸數(shù)次，15～30 ℃孵育5 min后，加0.2 mL氯仿，搖勻15 s，15～30 ℃孵育2～3 min，4 ℃離心15 min(離心半徑8 cm，12 000 r/min)。上清液移入另一EP管內(nèi)，加入0.5 mL異丙醇，4 ℃離心10 min(離心半徑8 cm，12 000 r/min)，加75％乙醇1 mL，震蕩混勻，4 ℃離心5 min(離心半徑8 cm，7 500 r/min)，吸去上清液，晾干5～10 min，加入焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解，55～60 ℃促溶10 min。采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定細(xì)胞總RNA在260 nm和280 nm處的吸光度(A)值，計(jì)算RNA的含量和純度。所有樣品的A260/A280均介于1.9～2.1之間，并根據(jù)260 nm吸光度定量。

1.2.1.3RT-PCR的檢測(cè) 取DEPC處理過(guò)的細(xì)胞溶液0.2 mL，加入下列反應(yīng)組分：2.6 μg RNA、1 μL隨機(jī)引物(50 ng/μL)，1 μL三磷酸脫氧核糖核苷(dNTP)10 mmol，4 μL 5×RT緩沖液，1 μL高效率逆轉(zhuǎn)錄酶(日本ReverTra Ace公司)，DEPC溶液補(bǔ)足至20 μL，室溫放置10 min，37 ℃保溫30 min，95 ℃ 5 min使酶失活，置于4 ℃ 1～5 min，完成cDNA的合成，所得cDNA產(chǎn)物于-20 ℃保存。于0.2 mL PCR反應(yīng)管中加入下列反應(yīng)組分：2 μL cDNA、2.25 μL 10×PCR緩沖液、0.5 μL dNTP(10 mmol)、25 pmol上游Wnt1引物、25 pmol下游Wnt1引物或0.5 μL甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物，0.5 μL TaqDNA聚合酶，滅菌水補(bǔ)足至25 μL。Wnt1及β-actin的引物序列(表1)，擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃終止反應(yīng)，1.5％瓊脂糖凝膠電泳45 min。

表1 引物序列

1.2.1.4RNA干擾實(shí)驗(yàn) MCF-7/ADR細(xì)胞接種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到50％融合時(shí)，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。化學(xué)合成的靶向Wnt1亞基的siRNA 雙鏈干擾序列為：5′-CCU CGU CUA CUU CGA GAA ATT-3′(正義鏈)，5′-UUU CUC GAA GUA GAC GAG GT-3′(反義鏈) 。

1.2.1.5MCF-7/ADR細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn) 將MCF-7/ADR細(xì)胞分為4組，(1)對(duì)照組：細(xì)胞中只采用培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；(2)Wnt1沉默組：MCF-7/ADR細(xì)胞加siRNA干擾處理；(3)多柔比星組：用多柔比星處理MCF-7/ADR細(xì)胞；(4)Wnt1沉默聯(lián)合多柔比星組：Wnt1沉默MCF-7/ADR后用多柔比星處理 。將細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，各組分設(shè)3個(gè)復(fù)孔，在37 ℃、5％ CO2的飽和濕度下培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁后加入終濃度為20 μg/mL的多柔比星，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入0.5 mg/mL MTT反應(yīng)4 h，棄去培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜(DMSO)100 μL，震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。選擇570 nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔A值，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，比較Wnt1基因沉默前、后MCF-7/ADR細(xì)胞對(duì)多柔比星耐藥性的變化。細(xì)胞抑制率=[1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值]×100％。

1.2.2免疫印跡法(Western blotting)檢測(cè)蛋白的表達(dá) 將各組細(xì)胞重懸，分別收集1×106個(gè)細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1次，離心去除上清液，加入細(xì)胞裂解液，室溫勻漿1 min，然后4 ℃離心15 min。取上清液作為樣品。5％聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，離心10 min(離心半徑8 cm，12 000 r/min)，上清液即為細(xì)胞總蛋白。50 μg細(xì)胞總蛋白行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，80～120 V電泳2 h，80 V轉(zhuǎn)印2 h；PBS洗膜10 min，加入包被液封閉過(guò)夜；再用PBS洗膜3次，加入 第一抗體(1∶400)和β-actin鼠抗人單克隆抗體(1∶400)，室溫孵育2 h；PBS洗膜2次，與第二抗體室溫孵育2 h；PBS洗膜2次，加入顯色液顯色15 min，顯色的硝酸纖維素膜經(jīng)UPV掃描儀掃描成像。

2 結(jié) 果

2.1Wnt1基因沉默前后MCF-7/ADR細(xì)胞對(duì)多柔比星敏感性的變化 對(duì)照組、Wnt1沉默組、多柔比星組及Wnt1沉默聯(lián)合多柔比星組的細(xì)胞存活率分別為(100.0±5.2)％、(84.3±4.1)％、(68.7±4.7)％和(42.3±3.5)％，其中，Wnt1沉默組、多柔比星組及Wnt1沉默聯(lián)合多柔比星組細(xì)胞的存活率與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.381，P<0.05)，Wnt1沉默聯(lián)合多柔比星組細(xì)胞的存活率最低。

2.2Wnt1基因沉默前后MCF-7/ADR細(xì)胞中Wnt1基因及蛋白質(zhì)的表達(dá) RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組及陰性對(duì)照組MCF-7/ADR細(xì)胞中Wnt1 mRNA的擴(kuò)增產(chǎn)物呈清晰條帶；用化學(xué)合成的雙鏈siRNA沉默Wnt1基因，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，MCF-7/ADR細(xì)胞中Wnt1 mRNA的表達(dá)明顯下調(diào)(圖1)。Western blotting檢測(cè)上述4組Wnt1蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其與Wnt1基因mRNA表達(dá)的變化一致，說(shuō)明siRNA轉(zhuǎn)然后抑制了Wnt1基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，同時(shí)也抑制了相應(yīng)蛋白的翻譯和表達(dá)，見(jiàn)圖1。

1：空白對(duì)照組；2：脂質(zhì)體對(duì)照組；3：陰性對(duì)照組；4：Wnt1 siRNA轉(zhuǎn)染組。

3 討 論

腫瘤多藥耐藥(MDR)是臨床惡性腫瘤化療的主要障礙，也是乳腺癌患者化療失敗、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的主要原因[5]。MDR發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，已有許多研究闡述了乳腺癌化療耐藥的機(jī)制，如P-糖蛋白(P-gp)[6]、多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)[7]和乳腺癌耐藥蛋白的過(guò)表達(dá)[8]，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)化療藥物的濃度降低以及谷膚甘膚S轉(zhuǎn)移酶(GSTS)酶性解毒作用的增強(qiáng)等[9]。隨著細(xì)胞技術(shù)的成熟，細(xì)胞信號(hào)通路與腫瘤多藥耐藥的關(guān)系已成為MDR機(jī)制和逆轉(zhuǎn)治療研究的新亮點(diǎn)。

近年來(lái)的研究表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活，參與了腫瘤的發(fā)生及其侵襲轉(zhuǎn)移的過(guò)程，而且還與腫瘤干細(xì)胞的關(guān)系密切，是調(diào)控腫瘤干細(xì)胞增殖與分化的一個(gè)重要信號(hào)通路[10-11]。Milovanovic等[12]在研究中用原位RNA雜交法檢測(cè)了正常乳腺組織和惡性乳腺癌組織的Wnt配體Wnt1、Wnt2、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7和Wnt10b的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Wnt1和Wnt6在正常和惡性組織中均強(qiáng)烈表達(dá)，Wnt7b在乳腺癌組織中下調(diào)。目前，認(rèn)為，Wnt通路致癌的關(guān)鍵是β-catenin降解障礙致使胞漿內(nèi)游離的β-catenin聚集并與Tcf/Lef結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞核，激活下游靶基因Cyclin D1、C-myc的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。Cyclin D1是調(diào)節(jié)細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期中增生期的主要因子，已被證實(shí)為原癌基因，其過(guò)度表達(dá)和失調(diào)控均可導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控異常從而發(fā)生腫瘤[13-15]。鑒于Wnt1在小鼠乳腺癌中的作用和人類乳腺癌中的表達(dá)，本文檢測(cè)了Wnt1基因的mRNA在乳腺癌多藥耐藥細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)Wnt1在乳腺癌細(xì)胞呈高表達(dá)，使用化學(xué)合成的雙鏈siRNA沉默Wnt1基因，可顯著下調(diào)Wnt1 mRNA的表達(dá)，Wnt1蛋白的表達(dá)也明顯減弱，說(shuō)明siRNA轉(zhuǎn)染后抑制了Wnt1基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，同時(shí)也抑制了相應(yīng)蛋白的翻譯和表達(dá)。本研究通過(guò)MTT試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，沉默后的MCF-7/ADR細(xì)胞對(duì)多柔比星的敏感性明顯增強(qiáng)，表明沉默Wnt1基因可以部分逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADR細(xì)胞對(duì)多柔比星的耐藥性。

綜上所述，Wnt1基因在乳腺癌細(xì)胞呈高表達(dá)，沉默Wnt1基因下調(diào)Wnt1基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，能顯著增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對(duì)多柔比星的敏感性，部分逆轉(zhuǎn)其對(duì)多柔比星的耐藥性，說(shuō)明Wnt/β-catenin信號(hào)通路可能在乳腺癌多藥耐藥中具有重要作用，為尋求克服MDR開(kāi)辟了新的方向。

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