劉 華，董 青

(江蘇省蘇州市中醫(yī)院檢驗(yàn)科 215007)

強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是一種危害骨骼系統(tǒng)與自身免疫相關(guān)的慢性疾病，癥狀表現(xiàn)為關(guān)節(jié)部位疼痛，行動(dòng)不便，嚴(yán)重者甚至喪失活動(dòng)能力，病理實(shí)驗(yàn)顯示為關(guān)節(jié)的纖維化和骨性強(qiáng)直，進(jìn)一步研究表明該疾病與人類白細(xì)胞抗原MHC-Ⅰ類分子HLA-B27高度相關(guān)，HLA-B27陽性成為AS的診斷指標(biāo)之一[1]。Dickkopf(DKK1)是一種含有2個(gè)富半胱氨酸區(qū)域的分泌性糖蛋白，參與抑制Wnt/β-catenin信號(hào)[2]，通過多種級(jí)聯(lián)反應(yīng)抑制成骨細(xì)胞，激活破骨細(xì)胞，破壞成骨與溶骨失衡。骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein,BMP-2)是一種生長(zhǎng)因子，在體內(nèi)、體外均有較強(qiáng)的骨誘導(dǎo)活性，可以使堿性磷酸酶的活性增高、骨橋蛋白、骨鈣蛋白及1型膠原蛋白合成增加[3]。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群在B27陽性患者和健康人之間的差別，通過酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測(cè)DKK1和BMP-2在AS患者和健康人中的含量，探討淋巴細(xì)胞亞群的結(jié)構(gòu)與AS患病的關(guān)系，并進(jìn)一步深入研究DKK1和BMP-2與AS疾病之間的關(guān)系，為研究AS疾病提供新的參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 隨機(jī)抽取30例HLA-B27陰性健康受試者(對(duì)照組)，60例HLA-B27陽性住院患者(AS組)，符合AS診斷標(biāo)準(zhǔn)。所有受試者均于當(dāng)天抽取外周靜脈血2 mL，EDTA-2K抗凝，標(biāo)本在6 h之內(nèi)測(cè)定。

1.2儀器與試劑 流式細(xì)胞儀購自美國(guó)BD公司；酶標(biāo)儀、洗板機(jī)購自芬蘭雷勃公司；離心機(jī)購自德國(guó)艾本德公司；隔水式培養(yǎng)箱購自海門市恒昌儀器廠。CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC(Cat NO:340499t)、CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PerCP/CD19-APC(Cat NO:340500+)購自BD公司；人DKK1和BMP-2酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒購自上海滬尚生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1流式細(xì)胞儀標(biāo)本處理 選2支試管，分別加入CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC、CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PerCP/CD19-APC 20 μL，將標(biāo)本充分混勻，分別加入50 μL標(biāo)本，振蕩器上充分混勻，避光放置15 min；加入溶血素2 mL，充分振蕩，避光放置10 min。1 500 r/min離心5 min棄上清液，加入生理鹽水2 mL振蕩，1 500 r/min離心5 min棄上清液，加入生理鹽水100 μL，充分振蕩混勻，待測(cè)。

1.3.2流式細(xì)胞儀器設(shè)置及數(shù)據(jù)分析 采用FACS Comp調(diào)整儀器FSC、SSC、FL1、FL2、FL3、FL4的電壓及補(bǔ)償。采用CELL Quest軟件獲取20 000個(gè)淋巴細(xì)胞，分析CD3、CD4、CD8、CD19、CD16+56細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的百分比。分別將他們與淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)相乘，得到各種表型細(xì)胞的絕對(duì)值。

表1 對(duì)照組與AS患者的淋巴細(xì)胞亞群百分比±s)

1.3.3ELISA分析 按照試劑盒說明操作，標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：標(biāo)準(zhǔn)品稀釋好5個(gè)梯度，每孔加樣量均為50 μL；加樣：分別設(shè)空白孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測(cè)樣品10 μL；溫育：封板膜封板37 ℃ 溫育30 min；洗滌：棄去液體，每孔加滿洗滌液，靜置 30 s后棄去，重復(fù)5次；加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL；溫育：步驟同上；洗滌：步驟同上；顯色：每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min；終止：每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)；測(cè)定：450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔A值。

2 結(jié) 果

與對(duì)照組相比，HLA-B27陽性AS疾病患者總T細(xì)胞含量百分比顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CD4+T和CD8+T細(xì)胞百分比明顯下降，而差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；T4/T8比值有所上升，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；B細(xì)胞含量百分比顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；NK細(xì)胞百分比含量略有上升，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。ELISA試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，通過標(biāo)準(zhǔn)品的梯度加樣測(cè)定并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，DKK1和BMP-2的標(biāo)準(zhǔn)曲線r2分別為0.998 5、0.997 9，HLA-B27陽性中DKK1和BMP-2的表達(dá)與對(duì)照組相比均顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。

表2 對(duì)照組與AS患者的DKK1和

▲：P<0.05，△：P<0.05，與對(duì)照組比較。

3 討 論

AS是與免疫學(xué)密切相關(guān)的疾病，有流行病學(xué)發(fā)病因素，也有遺傳學(xué)易感因素[4]。早在1973年Brewerton等[5]和Schlosstein等[6]就分別證實(shí)HLA-B27抗原與AS有強(qiáng)關(guān)聯(lián)性，并且 HLA-B27 陽性個(gè)體一生中患AS 的可能性為HLA-B27 陰性者的300倍，這提示HLA-B27基因或者是AS的疾病相關(guān)的基因，或者是與致病基因緊密連鎖。有越來越多的證據(jù)表明，HLA-B27基因或與AS疾病相關(guān),HLA-B27轉(zhuǎn)基因大鼠骨量的變化，發(fā)現(xiàn)有疾病傾向的 HLA-B27大鼠骨量減少，該實(shí)驗(yàn)表明HLA-B27基因缺陷與疾病中骨量丟失有關(guān)[7]。HLA-B27基因多態(tài)性影響機(jī)體相關(guān)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，本研究通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AS患者淋巴細(xì)胞亞群的含量百分比，探討淋巴細(xì)胞的變化與疾病的關(guān)系，總T細(xì)胞百分含量有顯著下降，B細(xì)胞百分含量顯著上升，表明在本檢測(cè)的患者體內(nèi)，T細(xì)胞和B細(xì)胞較對(duì)照組異常，可能與AS有關(guān)，而T4、T8、T4/T8及NK細(xì)胞的百分比含量均有所變化，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

雖然HLA-B27陽性與AS 有強(qiáng)相關(guān)性，但是至今AS的發(fā)病機(jī)制仍然不清楚，提示AS發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性。AS是危害骨骼系統(tǒng)的疾病，臨床主要表現(xiàn)為骶髂關(guān)節(jié)及中軸關(guān)節(jié)病變?yōu)樘卣鞯募怪P(guān)節(jié)炎癥疾病。DKK1蛋白屬于Dickkopf家族，可通過誘導(dǎo)beta-catenin磷酸化及降解來抑制Wnt信號(hào)通路，從而阻斷早期成骨細(xì)胞形成并誘導(dǎo)未成熟成骨細(xì)胞的凋亡[8]。DKK1是一種可溶性外泌型的糖蛋白，通過對(duì)Wnt信號(hào)的作用調(diào)節(jié)骨質(zhì)重塑。有研究表明，過度表達(dá)DKK1或DKK1缺失表達(dá)分別可導(dǎo)致嚴(yán)重骨質(zhì)丟失及大量骨質(zhì)形成[9]。另有研究表明，多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)細(xì)胞泌的DKK1通過與基質(zhì)細(xì)胞表面的 LRP5 和(或)LRP6相互作用抑制β-catenin 組裝，從而抑制成骨細(xì)胞發(fā)揮骨質(zhì)重塑功能[10]。以上證據(jù)表明，DKK1與骨質(zhì)的丟失和形成有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)測(cè)得AS患者DKK1表達(dá)顯著上升，這提示DKK1與AS疾病的發(fā)病相關(guān)，其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步深入研究。

BMP-2作為TGF-β超家族成員，是一種重要的成骨調(diào)節(jié)因子，有很強(qiáng)的促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的功能，并表達(dá)特異性的成骨細(xì)胞產(chǎn)物[11]。BMP-2可以促進(jìn)骨髓基質(zhì)間充質(zhì)細(xì)胞體外增值和誘導(dǎo)其分化為成骨前體細(xì)胞[12]。重組人BMP-2(rhBMP-2)可誘導(dǎo)再生軟骨和再生骨的形成[13]。本研究檢測(cè)HLA-B27陽性AS患者中BMP-2的表達(dá)與對(duì)照組相比顯著升高，AS與骨組織的逐步病變密切相關(guān)，有學(xué)者也提出BMPs類蛋白可能在AS發(fā)生過程中其重要作用，BMP-2的表達(dá)異常是否與患者骨組織病變有關(guān)，值得深入研究[14]。

雖然AS的研究廣泛而深入，但尚不能揭示其發(fā)病的根本原因，也表明AS發(fā)病的復(fù)雜性及影響因素的復(fù)雜性，有免疫因素、遺傳因素以及環(huán)境的互作，大多相關(guān)試驗(yàn)都在研究這些因素與AS的關(guān)系，而AS患者病理實(shí)驗(yàn)顯示為關(guān)節(jié)的纖維化和骨性強(qiáng)直，提示調(diào)節(jié)骨質(zhì)或者骨細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的基因也很有可能直接或間接參與AS的發(fā)病，而這些研究比較少見。本研究利用傳統(tǒng)的流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)，MHC-Ⅰ類分子HLA-B27陽性AS患者T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞異常，進(jìn)一步說明了AS的發(fā)病與HLA-B27遺傳基因及免疫因素相關(guān)。采用ELISA分析發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)骨質(zhì)和骨細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的兩個(gè)因子DKK1和BMP-2表達(dá)顯著升高，該兩種因子可能與AS發(fā)病有關(guān)，有待進(jìn)一步探討，這為深入研究AS發(fā)病機(jī)制及臨床的診斷和治療提供新的思路和方法。

[1]Díaz-PeoaR,López-VázquezA,López-LarreaC.OldandnewHLAassociationswithankylosingspondylitis[J].TissueAntigens，2012,80(3):205-213.

[2]Mao B,Wu W,Davidson G,et al.Kremen proteins are Dickkopf receptors that regulate Wnt/beta-catenin signaling[J].Nature,2002,417(6889):664-667.

[3]Nakashima K,de Crombrugghe B.Transcriptional mechanisms in osteoblast differentiation and bone formation[J].Trends Genet,2003,19(8):458-466.

[4]黃烽,楊春華.強(qiáng)直性脊柱炎臨床及免疫發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志,2001,17(6):281-285.

[5]Brewerton DA,Hart FD,Nicholls A,et al.Ankylosing spondylitis and HL-A 27[J].Lancet,1973,1(7809):904-907.

[6]Schlosstein L,Terasaki PI,Bluestone R,et al.High association of an HL-A antigen,W27,with ankylosing spondylitis[J].N Engl J Med,1973,288(14):704-706.

[7]Rauner M,Stupphann D,Haas M,et al.The HLA-B27 transgenic rat,a model of spondyloarthritis,has decreased bone mineral density and increased RANKL to osteoprotegerin mRNA ratio[J].J Rheumatol,2009,36(1):120-126.

[8]Pinzone JJ,Hall BM,Thudi NK,et al.The role of Dickkopf-1 in bone development,homeostasis,and disease[J].Blood,2009,113(3):517-525.

[9]Mukhopadhyay M,Shtrom S,Rodriguez-Esteban C,et al.Dickkopf1 is required for embryonic head induction and limb morphogenesis in the mouse[J].Dev Cell,2001,1(3):423-434.

[10]Tian E,Zhan F,Walker R,et al.The role of the Wnt-signaling antagonist DKK1 in the development of osteolytic lesions in multiple myeloma[J].N Engl J Med,2003,349(26):2483-2494.

[11]Ebara S,Nakayama K.Mechanism for the action of bone morphogenetic proteins and regulation of their activity[J].Spine(Phila Pa 1976),2002,27(16 Suppl 1):10-15.

[12]Kirker-Head C,Karageorgiou V,Hofmann S,et al.BMP-silk composite matrices heal critically sized femoral defects[J].Bone,2007,41(2):247-255.

[13]Sila-Asna M,Bunyaratvej A,Maeda S,et al.Osteoblast differentiation and bone formation gene expression in strontium-inducing bone marrow mesenchymal stem cell[J].Kobe J Med Sci，2007,53(1/2):25-35.

[14]Carter S,Braem K,Lories RJ.The role of bone morphogenetic proteins in ankylosing spondylitis[J].Ther Adv Musculoskelet Dis，2012,4(4):293-299.