姚紅衛(wèi),呂麗麗

(1.江蘇省常州市第四人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科 213001；2.徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院老年科，江蘇徐州 221008)

氣道重塑是哮喘的重要病理特征之一，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)氣道重塑的研究多集中于平滑肌增生/肥大、基底膜增厚導(dǎo)致的氣道壁增厚，對(duì)于血管生成等氣道血管改變方面的研究尚較少。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)是一種有效的多功能的血管調(diào)節(jié)因子，它通過與血管內(nèi)皮上的特異性受體結(jié)合，具有強(qiáng)大的促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、增加微血管通透性、誘導(dǎo)血管生成等多種功能。本研究通過建立慢性哮喘小鼠模型，了解VEGF在哮喘小鼠模型肺組織中的表達(dá)和對(duì)氣道血管生成的作用，以及早期應(yīng)用地塞米松對(duì)氣道重塑及VEGF表達(dá)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料 采用4～6周齡的BALB/c小鼠30只，雌性，體質(zhì)量18～22 g(購(gòu)自徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。飼養(yǎng)條件為清潔級(jí)環(huán)境，室溫為22～25 ℃，自由飲水無(wú)雞卵清蛋白(OVA)進(jìn)食。

1.2儀器與試劑 OVA(美國(guó)Sigma公司)，小鼠VEGF ELISA檢測(cè)試劑盒(深圳晶美公司)，兔抗小鼠Ⅷ因子多克隆抗體和Enivision 試劑(即用型，丹麥Dako公司)，VEGF 多克隆抗體及SABC免疫組化檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司)，奧林巴斯圖像采集系統(tǒng)，402A型超聲霧化器(江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備有限公司)。

1.3方法

1.3.1哮喘模型的制備和分組 將30只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，每組10只。生理鹽水對(duì)照組(A組)：以生理鹽水代替OVA致敏和激發(fā)。哮喘組(B組)：分別于第0、7、14及21天給小鼠腹腔注射OVA致敏液0.2 mL(含OVA 25 μg硫酸鋁鉀1 mg)在致敏后第28天，將小鼠置于一容器中(20 cm×40 cm×50 cm),每5只為1組，以2％的OVA溶液霧化激發(fā)，每天1次，每次30 min，連續(xù)7 d，然后再隔天1次共激發(fā)18次；觀察小鼠反應(yīng)，如出現(xiàn)煩躁不安、呼吸急促、流涎、大小便失禁和腹肌痙攣等為陽(yáng)性反應(yīng)。地塞米松干預(yù)組(C組)：每次激發(fā)前1 h予地塞米松(2 mg/kg)腹腔注射。

1.3.2標(biāo)本收集 末次霧化激發(fā)24 h后，以5％的水合氯醛0.4 mL腹腔注射麻醉小鼠，分離氣管，插入套管針，暴露胸腔，結(jié)扎右主氣管，用0.3 mL的磷酸鹽緩沖液(PBS)行左肺支氣管肺泡灌洗，反復(fù)3次，回抽率在80％以上，將收集的支氣管肺泡灌洗液(BALF)放入1.5 mL的EP管中，低速離心10 min，沉渣以1 mL Hank′s液重懸，行細(xì)胞計(jì)數(shù)。上清液-70 ℃保存待測(cè)定VEGF濃度。將右肺組織及氣管浸入10％中性甲醛溶液中固定，經(jīng)漂洗、脫水、包埋制成蠟塊，切片后行蘇木精-伊紅(HE)染色行病理學(xué)觀察，部分行免疫組化染色。

1.3.3BALF中活性VEGF的測(cè)定 應(yīng)用小鼠VEGF ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)BALF中VEGF水平，步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.4VEGF免疫組化染色 石蠟切片脫蠟至水，3％過氧化氫(H2O2)室溫孵育10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，經(jīng)微波處理，滴加比例為1∶100的VEGF一抗抗體，37 ℃孵育1 h；滴加二抗試劑盒中A液(生物素化山羊抗小鼠IgG),37 ℃孵育20 min；滴加二抗試劑盒中B液(試劑SABC)，37 ℃孵育30 min；用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液顯色，室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間。自來水充分沖洗，HE輕度復(fù)染，脫水，透明，封片。PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。VEGF陽(yáng)性染色為棕黃色或棕褐色顆粒，主要定位在胞漿。

1.3.5氣管血管密度的計(jì)算 病理切片采用Envision 法行抗Ⅷ因子免疫組化染色標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。用PBS代替一抗作陰性對(duì)照，以血管內(nèi)壁出現(xiàn)棕黃色或黃色顆粒狀為陽(yáng)性反應(yīng)。每個(gè)標(biāo)本觀察5張切片，每張切片在顯微鏡(×1 000)下于黏膜下層、黏膜固有層血管盡可能多的區(qū)域選10個(gè)視野，計(jì)數(shù)50個(gè)視野中(1 mm2)陽(yáng)性反應(yīng)的管腔樣結(jié)構(gòu)的總數(shù)。計(jì)數(shù)采取盲法，由兩位不知實(shí)驗(yàn)分組的醫(yī)師獨(dú)立完成。

1.3.6圖像分析 肺組織切片在顯微鏡下放大200倍，每組隨機(jī)選取直徑100～200 μm完整的小支氣管橫截面30個(gè)，采用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)，測(cè)定完整的無(wú)軟骨支氣管橫斷面的基底膜周徑(Pbm,μm)、管壁面積(WAt,μm2),計(jì)算支氣管管壁厚度(WAt/Pbm)表示氣道壁厚度。每張小鼠肺組織切片隨機(jī)選取10個(gè)視野，測(cè)定每組肺組織切片中的血管數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠BALF中細(xì)胞計(jì)數(shù)和活性VEGF含量的比較 分析不同組BALF中白細(xì)胞總數(shù)、EOS百分比及VEGF濃度變化，可見哮喘組明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，地塞米松組較哮喘組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2肺組織病理學(xué)改變 對(duì)照組小鼠氣道黏膜正常，管周無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管腔規(guī)則；與對(duì)照組比較，哮喘組氣道壁及氣道平滑肌明顯增厚，黏膜下層增寬，管腔狹窄，黏膜下、支氣管及血管周有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；地塞米松組上述改變明顯減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，但部分結(jié)構(gòu)仍有輕微破壞，見封2圖1～3。

2.3VEGF蛋白質(zhì)在小鼠氣道和肺內(nèi)的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示 哮喘組小鼠氣道黏膜上皮細(xì)胞、支氣管平滑肌、肺泡上皮細(xì)胞和血管周圍有大量棕黃色VEGF陽(yáng)性蛋白顆粒表達(dá)，對(duì)照組VEGF陽(yáng)性蛋白顆粒較少，地塞米松組VEGF呈弱陽(yáng)性表達(dá)，見封2圖4～6 。

表1 各組BALF中白細(xì)胞總數(shù)、EOS百分比及VEGF濃度

表2 各組氣管血管密度、支氣管壁厚度及肺組織血管計(jì)數(shù)的比較

圖7 BALF中VEGF水平與氣管血管密度成正相關(guān)(r=0.814，P<0.05)

圖8 BALF中VEGF水平與支氣管壁厚度成正相關(guān)(r=0.643，P<0.05 )

2.4各組氣管血管密度、WAt/Pbm及肺組織血管計(jì)數(shù)的變化 抗Ⅷ因子免疫組化染色及圖像分析軟件顯示：哮喘組的氣管血管密度、WAt/Pbm及肺組織血管計(jì)數(shù)明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；與哮喘組比較，地塞米松組氣管血管密度、WAt/Pbm及肺組織血管計(jì)數(shù)明顯減少(P<0.05)，見表2。

2.5相關(guān)性分析結(jié)果提示 BALF中VEGF的水平與氣管血管密度、支氣管壁厚度及肺組織中的血管數(shù)目皆呈正相關(guān)，見圖7～9。

圖9 BALF中VEGF水平與肺組織中血管數(shù)目成正相關(guān)(r=0.650，P<0.05)

3 討 論

氣道血管生成/血管增生是哮喘氣道重塑的一個(gè)重要病理特征，VEGF是一強(qiáng)有力的刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)因子，主要有兩大生物學(xué)功能：一是增加血管通透性，是已知最強(qiáng)的血管通透劑[1]；二是促進(jìn)血管生成的功能。因此它可能與支氣管哮喘的發(fā)病密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)過敏原可誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞表達(dá)VEGF mRNA，產(chǎn)生較多的VEGF，進(jìn)而改變氣道的通透性，導(dǎo)致氣道滲出、水腫[2]。Feltis等[3]發(fā)現(xiàn)，在哮喘患者支氣管黏膜及BALF中的VEGF水平較對(duì)照組明顯升高，且與支氣管黏膜下的血管數(shù)目呈正相關(guān)。Gomulka等[4]研究發(fā)現(xiàn)，在哮喘患者血清和誘導(dǎo)痰中VEGF 含量均顯著升高，VEGF和VEGF受體的水平與新血管的生成密切相關(guān)。同樣的，劉鑫等[5]研究發(fā)現(xiàn)，慢性哮喘模型大鼠的總氣管壁、氣管內(nèi)壁及氣道平滑肌增厚，肺組織VEGF mRNA及VEGF蛋白的表達(dá)增高，提示VEGF可能參與了慢性哮喘大鼠的氣道重塑過程。本研究顯示，VEGF在小鼠哮喘模型氣道及肺組織內(nèi)呈過度表達(dá)，并且BALF中VEGF的水平與氣管血管密度、支氣管壁厚度及肺組織中的血管數(shù)目皆呈正相關(guān)。提示測(cè)定VEGF水平可能會(huì)成為評(píng)價(jià)哮喘控制情況和氣道重塑嚴(yán)重程度很有價(jià)值的指標(biāo)。

糖皮質(zhì)激素(GCS)是治療哮喘的有效方法[6]。激素能緩解氣道的重塑，其機(jī)制之一就是通過降低血管滲透性和血漿蛋白的滲出從而減輕炎癥和氣道重塑。有研究表明激素能通過GCS受體通路降低VEGF的分泌和表達(dá)，而且這種作用是有時(shí)間依賴性和劑量依賴性的[7-8]。Chetta等[9]在對(duì)30例輕中度哮喘患者予氟替卡松吸入治療6周后發(fā)現(xiàn)，其氣道高反應(yīng)性、癥狀評(píng)分及炎癥細(xì)胞數(shù)均較治療前明顯下降。在體外實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，激素是VEGF強(qiáng)大的抑制劑，激素能下調(diào)哮喘患者氣道中促血管生成的炎癥介質(zhì)的水平[10]。本研究在應(yīng)用地塞米松治療后，哮喘組BALF中白細(xì)胞總數(shù)、EOS百分及VEGF濃度顯著下降，肺組織內(nèi)VEGF呈弱陽(yáng)性表達(dá)，其氣管血管密度、WAt/Pbm及肺組織內(nèi)血管計(jì)數(shù)均顯著減少。上述結(jié)果提示，地塞米松干預(yù)可降低哮喘模型的氣道炎癥，減緩氣道血管生成的過程。

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