彭 鵬，宋玉華

(東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬南京市第二醫(yī)院腫瘤科 221003)

人類白細胞介素-3受體α亞基(IL-3Rα)基因定位于擬常染色體區(qū)域Xp22.3和Yp11.3，編碼378個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，表達一個相對分子質(zhì)量70×103的糖蛋白，參與配體-受體的特異性識別與低親和力結(jié)合，參與活化信號的傳遞[1]。研究表明，IL-3Rα陽性細胞可在免疫缺陷小鼠體內(nèi)建立和保持白血病細胞群，IL-3Rα可作為未分化白血病干細胞的一個特異性標志[2]。國外的研究初步表明，急性白血病(AL)患者IL-3Rα的表達增高[3]。本實驗檢測了AML、ALL各亞型白血病患者IL-3Rα的表達，并結(jié)合患者臨床資料，以探討檢測IL-3Rα表達在AL中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血液科和兒科AL患者共94例，其中，男57例，女37例；中位年齡35歲；AML患者52例，ALL患者44例，初治患者80例、復(fù)發(fā)患者14例。所有患者均符合FAB或MICM分型診斷標準。除M3以外的AML患者接受標準的DA(柔紅霉素、阿糖胞苷)、TA(吡柔比星、阿糖胞苷)、NA(米托蒽醌、阿糖胞苷)聯(lián)合化療方案，M3患者主要用維A酸和/或三氧化二砷治療。ALL病例均接受標準的VDC(L)P(長春新堿、柔紅霉素、環(huán)磷酰胺、L-門冬酰胺酶、潑尼松)或VMC(L)P(長春新堿、米托蒽醌、環(huán)磷酰胺、L-門冬酰胺酶、潑尼松)化療方案。對照組選取10名健康者，為健康獻血員和骨髓移植供髓者，其中男5名，女5名；中位年齡29歲。

1.2方法

1.2.1主要試劑 RNA酶抑制劑、逆轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司；TRIzol抽提試劑盒、引物及相關(guān)試劑購自上海生工生物工程有限公司。

1.2.2標本處理 清晨空腹采集患者外周血5 mL(肝素抗凝)或抽取患者骨髓液2 mL，采用淋巴細胞分離液離心標本獲取單個核細胞(MNC)，計數(shù)5×107個MNC用于細胞總RNA的抽提，應(yīng)用TRIzol抽提試劑盒提取總RNA，置于-80 ℃保存。

1.2.3逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法測定IL-3Rα mRNA的表達 提取的總RNA利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA的合成，進一步行PCR擴增，IL-3Rα擴增片段長度為555 bp，其引物序列如下：上游引物：5′-TCT CCA GCG GTT CTC AAA GTT CCC ACA TCC-3′；下游引物：5′-CCC AGA CCA CCA GCT TGT CGT TTT GGA AGC-3′。擴增反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性40 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)后72 ℃再延伸7 min終止反應(yīng)。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后酶切鑒定，應(yīng)用PST1酶酶切，酶切片段長度為459 bp和96 bp，酶切產(chǎn)物由凝膠電泳鑒定。以GAPDH作為內(nèi)參，將同一標本IL-3Rα 和GAPDH的PCR擴增產(chǎn)物混勻，抽取混勻產(chǎn)物7 l加樣于1.7％瓊脂糖凝膠上，80 V恒壓電泳1 h，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并攝片，觀察電泳結(jié)果。

1.2.4免疫表型測定 采集患者骨髓液或外周血(幼稚細胞比例大于或等于50％)，肝素抗凝。流式細胞儀型號為FACS Calibur，激發(fā)光為488 nm氬離子，F(xiàn)ITC濾光片525 nm，PE濾光片575 nm。采用全血單抗雙標記法，檢測10 000個以上細胞，CD45-SSC設(shè)門法分析結(jié)果，所用干/祖細胞單抗為CD34。CD34抗原陽性細胞大于或等于20％為標準。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS11.5軟件進行分析，計量資料采用t檢驗、Levene方差齊性檢驗及秩和檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗、Fisher確切概率法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1IL-3Rα mRNA表達與AL的相關(guān)性 對照組10例未檢測到IL-3Rα的表達。T-ALL患者未檢測到IL-3Rα的表達，其余AML各組與B-ALL表達陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。AML和B-ALL初治、復(fù)發(fā)患者陽性率分別是39.13％(27/69)、50.00％(6/12)，兩組陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。IL-3Rα PCR擴增產(chǎn)物的PST1酶酶切結(jié)果(圖1)。部分AML、ALL患者IL-3Rα PCR擴增產(chǎn)物電泳，見圖2、3。

表1 AL患者 IL-3Rα表達與AL各型的關(guān)系[n(％)]

1：IL-3Rα PCR擴增產(chǎn)物；2：PST1酶酶切后產(chǎn)物；M：100 bp對照組。

2.2IL-3Rα表達與CD34的相關(guān)性 AML和B-ALL患者中IL-3Rα表達和CD34表達高度相關(guān)，CD34+組的IL-3Rα的表達顯著高于CD34-組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.3IL-3Rα表達與AL臨床預(yù)后的相關(guān)性 IL-3Rα陽性表達的AML和B-ALL患者白細胞計數(shù)、骨髓中原始細胞數(shù)較陰性表達組增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。IL-3Rα陽性組經(jīng)標準化療1～2個療程后CR率低于用類似化療的IL-3Rα陰性患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

1：對照樣本；2～6：AML患者樣本；M：100 bp對照組。

1、2：對照樣本；3、4：B-ALL患者樣本；5、6：T-ALL患者樣本；M：100 bp 對照組。

圖3 ALL患者IL-3Rα PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

表2 CD34+組與CD34-組患者IL-3Rα表達情況

3 討 論

白血病是造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，AL細胞可增殖存活，但極少分化成熟。IL-3可誘導(dǎo)血液系統(tǒng)淋系和髓系細胞自主增殖從而在白血病發(fā)病中有重要意義，IL-3還能促進祖細胞的分化，提示白血病是在表達IL-3R的前體細胞階段發(fā)生的[5]。IL-3通過與受體IL-3R結(jié)合發(fā)揮作用，而IL-3Rα決定了兩者結(jié)合的特異性。因此，筆者認為IL-3Rα可能是白血病發(fā)病的重要分子之一。Jordan等[2]研究認為IL-3Rα可以作為未分化白血病干細胞的一個特異性標志。近來研究指出，在AL患者中IL-3Rα表達有所增高[3]。

AML是成人AL的一種主要類型，其在臨床上及細胞遺傳學(xué)上均具有異質(zhì)性[4]。為進一步了解AL患者外周血IL-3Rα mRNA表達的情況，本研究采用RT-PCR方法檢測其mRNA的表達。本研究中，AML患者IL-3Rα陽性率為40.38％，M1～M5各亞型的表達無明顯差異。B-ALL患者IL-3Rα陽性率為41.38％，而健康人和T-ALL患者未檢測到IL-3Rα表達。有關(guān)IL-3Rα表達與AML FAB分型相關(guān)性，Munoz等[5]研究發(fā)現(xiàn)，M7患者不表達IL-3Rα，其余AML各型均有表達。Testa等[6]研究表明IL-3Rα在各個FAB亞型(M0～M7)的AML患者中均表達，而且分型與表達強弱程度無關(guān)。筆者沒有收集到M0、M6和M7的患者，未能進一步分析。本研究結(jié)果證實了AML和B-ALL患者IL-3Rα表達增高，這與Munoz等[5]、Giudice等[7]、Du等[8]研究報告相一致。由此，檢測IL-3Rα有助于B-ALL和T-ALL的鑒別，IL-3Rα在AML和B-ALL發(fā)病中有一定作用。

CD34抗原參與早期造血干/祖細胞的調(diào)控，研究認為在急性白血病細胞中CD34的高表達是急性白血病不良預(yù)后的一個重要因素[9]。與國外研究相似[10-11]，本研究結(jié)果也證實IL-3Rα的表達與CD34的表達相關(guān)，提示其可能表達于分化發(fā)育較早期的白血病細胞。

研究表明，IL-3Rα基因的異常高表達使造血細胞獲取增殖優(yōu)勢，進而導(dǎo)致白血病的發(fā)生發(fā)展。Testa等[6]研究提出，高表達IL-3Rα的患者化療后CR率低、生存期短。本研究結(jié)果表明，AML和B-ALL患者中IL-3Rα的陽性表達者的外周血白細胞計數(shù)、骨髓中白血病原始細胞比例增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而IL-3Rα的陽性表達與性別、年齡、血紅蛋白水平、血小板計數(shù)無關(guān)，提示了IL-3Rα的表達有可能促進白血病細胞的增殖。本研究還進一步分析了IL-3Rα表達與AL患者化療療效的相關(guān)性。在AML和B-ALL患者中，IL-3Rα陽性表達組標準化療1～2個療程后CR率低于陰性表達組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。因而，筆者認為IL-3Rα陽性表達可能是AML、B-ALL患者的一個不良預(yù)后因素。

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