馬桂芳，蔡紅星，丁鳳云，蘭建云

(1.鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇鹽城 224006；2.江蘇省鹽城市第一人民醫(yī)院 224005)

胃癌是嚴(yán)重危害人類健康的常見惡性腫瘤之一，中國是胃癌的高發(fā)區(qū)，每年新發(fā)現(xiàn)40萬胃癌患者，占世界胃癌發(fā)病人數(shù)的42％，病死率居各種癌癥之首。隨著分子生物學(xué)發(fā)展，人們逐漸對(duì)于腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移過程有了深入的認(rèn)識(shí)，并發(fā)現(xiàn)了一些與侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因及基因產(chǎn)物。近年來，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白(OPN)和肝細(xì)胞生長因子受體(c-Met)可作為反映腫瘤的生物學(xué)行為的參考指標(biāo)，在多種惡性腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移過程中都發(fā)揮著重要作用[1-7]。本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)胃癌組織中OPN、c-Met蛋白表達(dá)情況，探討它們與胃癌的浸潤轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料 收集鹽城市第一人民醫(yī)院病理科2011年1～12月手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的胃癌石蠟標(biāo)本69例，另取同期胃黏膜不典型增生組織標(biāo)本15例及因胃良性病變行部分胃切除的正常胃黏膜標(biāo)本10例作對(duì)照。所有患者術(shù)前均未接受放療、化療。

1.2主要試劑 鼠抗人骨橋蛋白單克隆抗體即用型(編號(hào)ZM-0174)、兔抗人c-Met多克隆抗體即用型(ZA-0412)購自北京中杉金橋公司；二抗及DAB顯色液均為福州邁新生物技術(shù)公司產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.1免疫組化染色方法 采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法(SP)檢測(cè)胃癌及正常胃黏膜組織中OPN、c-Met蛋白的表達(dá)。將存檔的石蠟塊行4 μm厚切片，常規(guī)脫蠟至水，具體操作步驟按說明書進(jìn)行。用已知的OPN和c-Met陽性胃癌切片染色作陽性對(duì)照，用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3.2結(jié)果判定 OPN表達(dá)以細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色或棕褐色為陽性染色；c-Met的表達(dá)以細(xì)胞質(zhì)(少數(shù)細(xì)胞膜)呈棕黃色或棕褐色為陽性染色。每份標(biāo)本置高倍鏡下選取5個(gè)不同視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)腫瘤細(xì)胞，由兩位病理醫(yī)師進(jìn)行盲法判讀，計(jì)算陽性腫瘤細(xì)胞所占的百分?jǐn)?shù)。結(jié)果分為4級(jí)：未見明顯陽性細(xì)胞為“-”；陽性細(xì)胞數(shù)<25％為“+”；25％～50％為“+ +” ；>50％為“+ + +”。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，病理參數(shù)采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Spearman分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1OPN、c-Met在胃癌和不典型增生、正常胃黏膜組織中的表達(dá) OPN蛋白在胃癌組織中陽性染色主要定位于細(xì)胞質(zhì)，為棕黃色或棕褐色顆粒(封2圖1)。OPN在胃癌組織中的陽性表達(dá)率為69.6％(48/69),胃黏膜不典型增生組織40％(6/15)，正常胃黏膜組織20％(2/10)。結(jié)果顯示，OPN蛋白在胃癌組織的表達(dá)高于胃黏膜不典型增生組織(χ2=4.691，P<0.05)和正常胃黏膜組織(χ2=7.225，P<0.01)。c-Met陽性染色主要定位于細(xì)胞質(zhì)，少數(shù)在細(xì)胞膜，為棕黃色或棕褐色顆粒(封2圖2)。c-Met在胃癌組織中的陽性表達(dá)率為65.2％(45/69),胃黏膜不典型增生組織26.7％(4/15)，正常胃黏膜組織10％(1/10)。結(jié)果顯示，c-Met蛋白在胃癌組織的表達(dá)顯著高于胃黏膜不典型增生組織(χ2=7.534，P<0.01)和正常胃黏膜組織(χ2=8.796，P<0.01)。

2.2OPN、c-Met表達(dá)與腫瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系 胃癌組織中OPN表達(dá)與腫瘤臨床TNM分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有相關(guān)性(P<0.01)；而與患者年齡、腫瘤大小、腫瘤組織分化等無明顯相關(guān)性。c-Met表達(dá)與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床TNM分期等有相關(guān)性(P<0.01)；與患者年齡、腫瘤大小、浸潤深度、腫瘤組織分化等無相關(guān)性，見表1。

2.3胃癌組織中OPN和c-Met表達(dá)的相關(guān)性 在48例OPN陽性的胃癌組織中，c-Met陽性者37例(77.1％)，21例OPN陰性胃癌組織中，c-Met陽性者8例(38.1％)(γ=0.352 48,P<0.05)，相關(guān)分析表明，胃癌組織中OPN蛋白的表達(dá)與c-Met蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。

表1 胃癌OPN與c-Met蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)關(guān)系(n)

3 討 論

OPN是近年來發(fā)現(xiàn)的一種糖磷酸化蛋白，是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中一種重要的非膠原蛋白。OPN是一種轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白，能夠促進(jìn)腫瘤組織細(xì)胞的生存、增殖和遷移，參與腫瘤組織中毛細(xì)血管床的形成，在腫瘤的發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用。人OPN基因定位于人染色體4q13，OPN蛋白中的特異精氨酸一甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-AsP，RGD)序列與許多細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的黏附序列相同，對(duì)OPN的黏附功能起著重要作用。在RGD結(jié)構(gòu)域下游6個(gè)氨基酸處有凝血酶裂解位點(diǎn)，凝血酶可把OPN裂解成2個(gè)大小相近的片段C端和N端，以暴露整合素和CD44等結(jié)合位點(diǎn)。OPN主要是通過與整合素和CD44結(jié)合參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲和轉(zhuǎn)移[1],目前許多研究表明OPN在肺癌[2]、肝癌[3]、胃癌[4]、乳腺癌[5]、宮頸癌[6]、卵巢癌[7]等多種腫瘤中呈高水平表達(dá)，與本研究的結(jié)果相一致。Hotte等[8]通過用癌基因H-ras轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞模型能使其獲得致瘤性,ras表達(dá)水平升高的同時(shí)OPN分泌增加,使細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng);然而轉(zhuǎn)染OPN反義RNA后,細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力顯著下降，說明OPN和腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究表明，OPN的表達(dá)與腫瘤的浸潤深度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，表明了病情的進(jìn)展程度,可以作為判斷胃癌患者預(yù)后的良好指標(biāo)。

原癌基因c-Met的編碼產(chǎn)物是肝細(xì)胞生長因子(HGF)的細(xì)胞膜受體，屬酪氨酸激酶受體，在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。c-Met位于人類7號(hào)染色體長臂(7q31)。HGF與其受體c-Met蛋白相結(jié)合，啟動(dòng)一系列跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，刺激多種類型細(xì)胞的增殖、分化、運(yùn)動(dòng)及形態(tài)發(fā)生，對(duì)多種組織器官的生長發(fā)育具有重要的生理調(diào)節(jié)作用[9]。異常因素的持續(xù)刺激，使HGF/c-Met系統(tǒng)過度激活，細(xì)胞過度表達(dá)HGF或c-Met時(shí)，常常導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生癌變，通過影響細(xì)胞的黏附、ECM的降解、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)及腫瘤血管生成等促進(jìn)腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移。大量研究表明在人的許多腫瘤組織中有c-Met蛋白過表達(dá)，如肺癌[10]、胰腺癌[11]、肝癌[12]、胃癌[13]、卵巢癌[14]等。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著臨床TNM分期的增加，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生等c-Met在蛋白水平也有逐漸增高的趨勢(shì),提示隨著腫瘤惡性程度的增加，c-Met的表達(dá)率也增加，患者的預(yù)后也差，與國內(nèi)外文獻(xiàn)一致。

OPN和c-Met在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中有許多聯(lián)系，Bramwell等[15]研究表明，OPN誘導(dǎo)癌細(xì)胞遷移依賴于HGF/c-Met途徑的激活。Medico等[16]證實(shí)，HGF與c-Met結(jié)合后激活Ras、PI-3K、PLC-γ及STAT信號(hào)通路，促進(jìn)OPN生成，并使OPN與CD44結(jié)合，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤、轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中OPN蛋白的表達(dá)與c-Met蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，說明二者在腫瘤的發(fā)生發(fā)展，浸潤轉(zhuǎn)移中可能存在一定的內(nèi)在聯(lián)系性，并共同促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。因此OPN和c-Met可作為反映胃癌生物學(xué)行為的參考指標(biāo)，有助于胃癌的預(yù)后判斷，并提供腫瘤轉(zhuǎn)移基因治療的干預(yù)靶點(diǎn)。

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