張 銘,張一鳴,蔣麗霞,歐陽俊,周蓓蓓

(南京醫(yī)科大學附屬常州市婦幼保健院：1.檢驗科；2.病理科；3.婦科，江蘇常州 213003)

宮頸癌是女性最常見的生殖道惡性腫瘤，在發(fā)展中國家占女性惡性腫瘤的第1位[1]。宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)是與宮頸浸潤癌密切相關(guān)的一組癌前期病變,它反映宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的連續(xù)過程，但CIN不一定都發(fā)展為癌,CINⅠ期和Ⅱ期是可逆的,Ⅲ期是不可逆的[2]。轉(zhuǎn)錄因子Slug在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起重要作用[3-4]，但其在宮頸癌、CIN組織中的表達情況及意義文獻報道甚少。本研究采用實時定量PCR方法檢測了Slug mRNA 在宮頸癌、CIN、慢性宮頸炎及正常宮頸組織中的表達，分析宮頸癌組 Slug 表達與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，探討Slug基因在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2010年3月至2011年12月，常州市婦幼保健院婦科手術(shù)切除的宮頸癌患者組織56例，其中鱗癌46例；腺癌10例；年齡21～68歲，中位年齡46歲，術(shù)前均未接受化療和放療。CIN組織60例(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期各20例)；年齡22～65歲，中位年齡45歲。同期收集因子宮肌瘤而行子宮全切或因?qū)m頸炎癥行宮頸活檢的正常宮頸或?qū)m頸炎癥組織標本共35例為對照組，年齡22～66歲，中位年齡46歲。手術(shù)取材后立即置于-70 ℃凍存?zhèn)溆?，所有病例均?jīng)病理檢查確診?；颊呔橥?，研究符合常州市婦幼保健院倫理委員會所制定的倫理學標準并得到委員會的批準。

1.2儀器和試劑 PCR儀(2720，ABI公司)、實時熒光定量PCR儀(CFX96,Bio-Rad公司)、核酸蛋白測定儀(Eppendorf公司)、TRIzol試劑(Invitrogen公司)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas公司)、實時定量PCR檢測試劑盒(Toyobo公司)。

1.3方法

1.3.1總RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄 取50～100 mg組織，放入勻漿器中并加入1 mL TRIzol提取RNA，核酸蛋白質(zhì)測定儀測定RNA樣品濃度，取A260/A280在1.80～2.0之間，且瓊脂糖凝膠電泳鑒定質(zhì)量好的RNA標本進行逆轉(zhuǎn)錄(不符合要求的RNA重新提取)，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，以oligo(dT)為引物，合成cDNA.

1.3.2引物設(shè)計 根據(jù)GenBank已知基因序列編號(Slug：NM_003068.4，β-actin:NM_001101.3)設(shè)計引物，由上海生工公司合成，引物序列為：Slug 正向:5′-CCT GGT TGC TTC AAG GAC AC-3′，反向：5′-TCC ATG CTC TTG CAG CTC TC-3′,產(chǎn)物長度為395 bp。β-actin正向：5′-CAC GAA ACT ACC TTC AAC TCC-3′,反向：5′-CAT ACT CCT GCT TGC TGA TC-3′,產(chǎn)物長度為265 bp。

1.3.3實時定量PCR檢測 常規(guī)方法構(gòu)建Slug基因標準質(zhì)粒為標準品[5-6]，稀釋成103～107copy/μL濃度，構(gòu)建標準曲線。實時定量PCR反應總體積20 μL，包括： 2×SYBR Green Master Mix 10 μL，cDNA模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL(10 μmol/L)，ddH2O 8 μL。循環(huán)參數(shù)為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s,Slug(60 ℃)/β-actin(56 ℃) 30 s,72 ℃ 30 s,Slug(78 ℃)/β-actin(84 ℃)8 s后采集熒光,共35個循環(huán),每個樣本重復測定3次。由熒光定量PCR分析儀附帶軟件測定并繪制標準曲線。Slug mRNA相對表達水平=Slug cDNA拷貝數(shù)/β-actin cDNA拷貝數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1標準曲線建立及線性檢測范圍 實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，Slug基因?qū)崟r定量PCR標準曲線方程為Y=- 3.514X+45.110，在5個數(shù)量級檢測范圍內(nèi)，其起始模板量對數(shù)值(X)與相應反應循環(huán)數(shù)(Y)有良好的線性相關(guān)(r2=1.000)，實時定量PCR效率E為92.6％，說明擴增效率較好，見圖1、2。

圖1 Slug基因SYBR Green實時熒光PCR標準曲線

圖2 Slug基因SYBR Green實時熒光PCR擴增曲線

2.2不同宮頸組織中Slug mRNA 的表達 對照組、CIN組、宮頸癌組Slug mRNA 相對表達水平分別為(1.33±0.32) ×10-2、(2.99±0.95) ×10-2、(4.69±1.02) ×10-2，3組間差異有統(tǒng)計學意義(F=56.70,P<0.01)。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組、CIN組Slug mRNA 相對表達水平高于對照組(P<0.01)，宮頸癌組Slug mRNA 相對表達水平高于CIN組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.3宮頸癌組織中Slug mRNA 相對表達量與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 實時定量PCR檢測所得Slug mRNA 相對表達量與宮頸癌的FIGO分期、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(t分別為2.23、2.37,P<0.05),但與年齡、腫瘤大小、病理類型、分化程度無關(guān)(t分別為0.30、0.42、0.81、1.83，P>0.05)，見表2。

表2 宮頸癌組織中Slug相對表達量與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討 論

宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多步驟、多因素的過程[7]，它是由CIN逐步形成的，經(jīng)歷了CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、原位癌、早期浸潤癌和浸潤癌的連續(xù)發(fā)展過程。高危型人乳頭瘤病毒感染是宮頸癌前病變和浸潤性宮頸癌發(fā)生的必要條件[8]，其他一些癌基因、抑癌基因也在宮頸癌前病變、宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transitions,EMT)是上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，以上皮細胞極性的喪失及其間質(zhì)特性的獲得為主要特征,并與腫瘤細胞的原位侵襲和遠處轉(zhuǎn)移有著密切的關(guān)系[9]。E-鈣黏著蛋白(E-cadherin)的減少或丟失是EMT 最重要的標志性變化。Slug基因是鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail家族成員之一，能夠下調(diào)E-cadherin，誘導EMT的發(fā)生[10]。多項研究表明，Slug基因過度表達與胃癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[11-13]，其在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過程中作用尚未見文獻報道。

本研究采用實時定量PCR方法檢測宮頸癌、CIN、慢性宮頸炎及正常宮頸組織中的Slug 基因的表達，結(jié)果顯示，對照組、CIN組、宮頸癌組Slug mRNA 相對表達水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，從正常宮頸及慢性宮頸炎到CIN再到宮頸癌的演變中，Slug基因表達水平逐漸升高，提示Slug表達量的提高可能出現(xiàn)于宮頸惡性轉(zhuǎn)化的早起，可能具有促進這些損傷惡性轉(zhuǎn)化的作用，表明Slug表達上調(diào)與CIN、宮頸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，有可能作為宮頸癌發(fā)生的早期標志物。本研究還發(fā)現(xiàn)，Slug表達水平與宮頸癌的FIGO分期、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，Ⅱ期相對表達量高于Ⅰ期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但與年齡、腫瘤大小無關(guān)，不能為子宮頸癌的病理類型、分化程度提供依據(jù)。說明Slug不僅參與了CIN、宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展，還可能與宮頸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

綜上所述，Slug在CIN、宮頸癌組織中的表達增加，可能通過下調(diào)E-cadherin，誘導EMT的發(fā)生，參與了宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移。隨著對Slug基因研究的深入，將有助于闡明宮頸癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移的本質(zhì)，對臨床早期診斷宮頸癌、判斷CIN的發(fā)展及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移也有重要指導意義。

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