馬群英，江美玲，馬鳳麗，李 釗，許岸高

(1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院胃腸科，廣州 510515；2.惠州市第一人民醫(yī)院/惠州市醫(yī)學(xué)研究所 516001)

大腸癌是世界上第三大腫瘤，也是導(dǎo)致腫瘤性死亡的第三大原因，其年新發(fā)病例大約為100萬(wàn)，年病死人數(shù)超過(guò)50萬(wàn)[1]。近年來(lái)，由于中國(guó)人民生活方式、飲食結(jié)構(gòu)、環(huán)境因素等的改變，大腸癌的發(fā)病率及病死率呈逐年上升趨勢(shì)。因而對(duì)大腸癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的進(jìn)一步研究，以尋求新的診斷及治療靶標(biāo)十分必要。microRNAs(miRNAs)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的長(zhǎng)約21～25 nt單鏈RNA，它通過(guò)與靶mRNA不完全互補(bǔ)配對(duì)抑制蛋白翻譯，在基因表達(dá)調(diào)控包括腫瘤形成和發(fā)展中扮演重要角色[2]，它的出現(xiàn)讓人們看到了大腸癌的診斷和治療的新曙光。本文通過(guò)探針法逆轉(zhuǎn)、實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)52例腸癌中miRNA-20a的表達(dá)，分析其與分期及其臨床病理特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇惠州中心醫(yī)院52例大腸癌患者外科手術(shù)切除的新鮮腸癌組織及其相應(yīng)癌旁正常組織，術(shù)后經(jīng)病理檢查確證。組織獲得后立即置于-80 ℃超低溫冰箱。所有患者術(shù)前均未行放、化療與免疫治療。其中，男25例，女27例；年齡28～84歲，平均59.9歲。TNM分期以美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)/國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)結(jié)直腸癌TNM分期系統(tǒng)(第6版)為標(biāo)準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1主要試劑 TRIzol試劑購(gòu)自Invitrogen， miRNA-20a RT Primer、miRNA-20a Real time、U6 RT Primer、U6 Real time、2×PCR TaqMan Universal PCR，TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit 均購(gòu)自ABI公司。

1.2.2組織總RNA提取 -80 ℃超低溫冰箱保存組織(30 mg)，于冰上碾磨器磨碎，加入1 mL TRIzol試劑，按說(shuō)明書操作提取總RNA,Nanodrip(ND-1000,USA) 檢測(cè)RNA溶液A260/280 nm比值及濃度，取A260/280 nm在1.8～2.1者進(jìn)一步試驗(yàn)。

1.2.3cDNA合成及實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè) 取100 ng總RNA按試劑說(shuō)明書操作逆轉(zhuǎn)錄cDNA：反應(yīng)條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。然后按2×PCR TaqMan Universal PCR 試劑盒說(shuō)明，以miRNA-20a 和 U6 第一鏈為模板，用miRNA-20a 和 U6 熒光探針為引物擴(kuò)增。以上熒光 PCR 檢測(cè)均在ABI PRISM 7500(Applied Biosystems,USA)型熒光定量PCR儀操作完成，所有反應(yīng)設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，檢測(cè)方法為相對(duì)定量分析2-△△Ct法。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)Q-Q圖、偏峰度計(jì)算和Kolmogorov-SmiRnov檢驗(yàn)(D檢驗(yàn))推斷數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，數(shù)據(jù)均采用非參數(shù)檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以中位數(shù)(25％分位數(shù)至75％分位數(shù))表示。配對(duì)資料采用配對(duì)資料的wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)(wilcoxonsigned-ranktest)，miRNAs與其他臨床病理資料的檢驗(yàn)組間比較采用Mann-whitney檢驗(yàn)，分析miRNAs與等級(jí)變量相關(guān)關(guān)系采用Jonchheere-Terpstra檢驗(yàn)。以P<0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1miRNA-20a在腸癌組織中高表達(dá) 采用TaqMan?探針法實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miRNA-20a表達(dá)，以U6為內(nèi)參，2-△△Ct法分析腸癌組織相對(duì)癌旁正常組織的相對(duì)表達(dá)量。miRNA-20a在65％(34/52)的腸癌組織中高表達(dá)；與癌旁正常組織比較，miRNA-20a在腸癌組織中的相對(duì)表達(dá)量為2.05，高于癌旁正常組織(圖1)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-3.597，P=0.000)。

圖1 miRNA-20a在大腸癌中的表達(dá)

圖2 miRNA-20a在不同TNM分期中的表達(dá)

圖3 miR-20在淋巴結(jié)陰/陽(yáng)性組織中的表達(dá)

2.2miRNA-20a表達(dá)水平與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān) miRNA-20a的表達(dá)在TNM不同分期中表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(T=3.223,P=0.001)。隨著TNM分期越高，miRNA-20a表達(dá)越高(圖2，表1)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腸癌組織中miRNA-20a表達(dá)明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(Z=-2.141,P=0.037)(圖3，表1)。miRNA-20a表達(dá)和性別、年齡、腫塊位置、組織分化程度無(wú)關(guān)，見表1。

表1 大腸癌中miRNA-20a的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

1：miRNAs相對(duì)表達(dá)的中位數(shù)，括號(hào)中表示25％及75％百分位數(shù)；2：以結(jié)腸脾曲為界分為近端結(jié)腸及遠(yuǎn)端結(jié)腸。

3 討 論

一種miRNAs可以調(diào)節(jié)多種靶基因，同一靶基因也可通過(guò)不同miRNAs調(diào)節(jié)，同時(shí)，miRNAs也可被各種調(diào)節(jié)因子所調(diào)節(jié)，miRNAs調(diào)節(jié)因子、miRNAs及其靶基因構(gòu)成了錯(cuò)綜復(fù)雜的基因調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，而腫瘤中差異表達(dá)的miRNAs也可通過(guò)交叉的網(wǎng)絡(luò)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。miRNAs的發(fā)現(xiàn)及其研究的深入，為了解復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制開辟了新的領(lǐng)域，也為癌癥的早期篩查、診斷、治療等方面提供新的理論基礎(chǔ)及方法。

miRNA-20a是miRNA-17-92家族一員，其在不同腫瘤中作用不同。miRNA-20a在前列腺癌，尤其是低分化前列腺癌中表達(dá)較高[3-4]，前列腺癌細(xì)胞系過(guò)表達(dá)miRNA-20a后凋亡減少；miRNA-20a也可通過(guò)調(diào)節(jié)Fas表達(dá)增加骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力[5]；miRNA-20a還可調(diào)節(jié)淀粉樣前蛋白促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖和侵襲[6]。以上研究證實(shí)miRNA-20a具有致癌作用，同時(shí)，miRNA-20a也具有抑癌作用。miRNA-20a過(guò)表達(dá)可抑制胰腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[7]；miRNA-20a在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)降低，可抑制細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移[8]，乳腺癌術(shù)后miRNA-20a表達(dá)下降[9]，還可通過(guò)下調(diào)Cyclin D1表達(dá)而抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和克隆形成[10]。因而miRNAs在不同基因背景中作用不同，一種miRNA在某一癌癥中作用需結(jié)合組織表達(dá)、生存分析及細(xì)胞動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等驗(yàn)證，以確定其促癌或抑癌作用，從而為將來(lái)臨床治療應(yīng)用等提供理論指導(dǎo)。

本研究證實(shí)miRNA-20a在腸癌中表達(dá)增加，與癌旁正常組織相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。有研究證實(shí)miRNA-20a在腸癌組織的高表達(dá)[11-13]，與本研究結(jié)果一致。同時(shí)，本研究結(jié)果表明腸癌組織中miRNA-20a還與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，說(shuō)明miRNA-20a可能參與調(diào)節(jié)大腸癌轉(zhuǎn)移過(guò)程。且有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iRNA-20a高表達(dá)與生存期降低有關(guān)[14]；敲低SW620細(xì)胞中miRNA-20a可增加化療敏感性，而過(guò)表達(dá)SW480中miRNA-20a可導(dǎo)致化療抵抗[15]?？梢?，miRNA-20a在大腸癌中的作用文獻(xiàn)報(bào)道趨于一致，即miRNA-20a在大腸癌中高表達(dá)，與患者生存期及化療抵抗有關(guān)，在大腸癌中可能具有促癌作用。

[1]Parkin DM,Bray F,Ferlay J,et al.Global cancer statistics,2002[J].CA Cancer J Clin,2005,55(2):74-108.

[2]Hurst LD.Preliminary assessment of the impact of microRNA-mediated regulation on coding sequence evolution in mammals[J].J Mol Evol,2006,63(2):174-182.

[3]Pesta M,Klecka J,Kulda V,et al.Importance of miRNA-20a expression in prostate cancer tissue[J].Anticancer Res,2010,30(9):3579-3583.

[4]Li X,Pan JH,Song B,et al.Suppression of CX43 expression by miRNA-20a in the progression of human prostate cancer[J].Cancer Biol Ther,2012,13(10):890-898.

[5]Huang G,Nishimoto K,Zhou Z,et al.miRNA-20a Encoded by the miR-17-92 Cluster Increases the Metastatic Potential of Osteosarcoma Cells by Regulating Fas Expression[J].Cancer Res,2012,72(4):908-916.

[6]Fan X,Liu Y,Jiang J,et al.miRNA-20a promotes proliferation and invasion by targeting APP in human ovarian cancer cells[J].Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai),2010,42(5):318-324.

[7]Yan H,Wu J,Liu W,et al.MicroRNA-20a overexpression inhibited proliferation and metastasis of pancreatic carcinoma cells[J].Hum Gene Ther,2010,21(12):1723-1734.

[8]Yu Z,Willmarth NE,Zhou J,et al.microRNA 17/20 inhibits cellular invasion and tumor metastasis in breast cancer by heterotypic signaling[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2010,107(18):8231-8236.

[9]Schwarzenbach H,Milde-Langosch K,Steinbach B,et al.Diagnostic potential of PTEN-targeting miR-214 in the blood of breast cancer patients[J].Breast Cancer Res Treat,2012,134(3):933-941.

[10]Yu Z,Wang C,Wang M,et al.A Cyclin D1/microRNA 17/20 regulatory feedback loop in control of breast cancer cell proliferation[J].J Cell Biol,2008,182(3):509-517.

[11]Schetter AJ,Leung SY,Sohn,JJ,et al.MicroRNA expression profiles associated with prognosis and therapeutic outcome in colon adenocarcinoma[J].JAMA,2008,299(4):425-436.

[12]Yantiss RK,Goodarzi M,Zhou XK,et al.Clinical,pathologic,and molecular features of early-onset colorectal carcinoma[J].Am J Surg Pathol,2009,33(4):572-582.

[13]Luo X,Burwinkel B,Tao S,et al.MicroRNA signatures:novel biomarker for colorectal cancer[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2011,20(7):1272-1286.

[14]Valladares-Ayerbes M,Blanco M,Haz M,et al.Prognostic impact of disseminated tumor cells and microRNA-17-92 cluster deregulation in gastrointestinal cancer[J].Int J Oncol,2011,39(5):1253-1264.

[15]Chai H,Liu M,Tian R,et al.miRNA-20a targets BNIP2 and contributes chemotherapeutic resistance in colorectal adenocarcinoma SW480 and SW620 cell lines[J].Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai),2011,43(3):217-225.