張錦巍,井麗娟,孫亞平，李 聰，董貴成

(內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭師范學(xué)院,內(nèi)蒙古包頭 014030)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行性退行性疾病，臨床特征表現(xiàn)為高級(jí)認(rèn)知功能、記憶功能障礙和行為異常等[1]。主要病理改變包括大腦皮層和海馬區(qū)胞外老年斑沉積和胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)，老年斑塊的主要成分是淀粉樣蛋白Aβ40和Aβ42[2-4]。γ分泌酶切割底物C99生成強(qiáng)自聚性的Aβ，γ分泌酶是產(chǎn)生Aβ的最后一步也是限速步驟。因此，研究γ分泌酶的活性調(diào)控因子,對(duì)于尋找AD的治療藥物有一定指導(dǎo)和借鑒意義。

γ分泌酶由PS、NCT、APH及Pen2四大核心部分組成的具有復(fù)雜空間結(jié)構(gòu)和一定活性中心的復(fù)合物[3-7]，主要參與APP和Notch等重要跨膜蛋白的切割.可切割A(yù)PP經(jīng)β-分泌酶切割的產(chǎn)物C99而生成多種Aβ[8]。

CD147是一種高度糖基化的球蛋白，編碼基因位于人19號(hào)染色體編碼269個(gè)氨基酸[9]。 CD147在體內(nèi)分布廣泛， 同時(shí)表現(xiàn)為高糖型CD147[相對(duì)分子質(zhì)量為(40～66)×103]和低糖型CD147[相對(duì)分子質(zhì)量為33×103]。本文通過CD147 cDNA轉(zhuǎn)染MEF(KO),以研究其對(duì)γ分泌酶活性的影響。

1 材料與方法

1.1材料 MEF(KO)由康斯坦茨大學(xué)提供、FBS、MEF、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基、G148、CD147 cDNA、胰酶、混合型酶抑制劑、CHAPSO、預(yù)清潔ProteinG Beads、載有PS-1抗體的ProteinA Beads、 CD147一抗、CD147二抗、PVDF膜、ECL試劑、底物C99、Aβpeptide40與 Aβ42的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)反應(yīng)試劑盒、CO2培養(yǎng)箱、轉(zhuǎn)膜儀、顯微鏡等。

1.2方法

1.2.1選擇生長(zhǎng)活力強(qiáng)的細(xì)胞 將MEF(KO)在 100 mm×20 mm的平板上培養(yǎng)成為幾個(gè)梯度。選擇36 h內(nèi)覆蓋率達(dá)70％～90％的進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2CD147 cDNA轉(zhuǎn)染 (1)吸取CD147 cDNA 25 μg加入到1 mL OPTI-MEM 低血清培養(yǎng)基混勻，記做A,室溫靜置10 min。(2)吸取脂質(zhì)體60 μL加入到1 mL OPTI-MEM 低血清培養(yǎng)基混勻,記作B，室溫下靜置10 min。(3)將上述A、B溶液混合均勻，室溫靜置15 min。(4)吸出 MEF(KO)細(xì)胞培養(yǎng)平板的MEF，用未加抗菌藥物的選擇培養(yǎng)基洗滌3次。(5)將A、B混合溶液加入覆蓋80％～90％的平板并再加8 mL選擇培養(yǎng)基。(6)培養(yǎng)12 h以后換成不含抗生素含10％FBS的MEF。(7)培養(yǎng)36 h后將1個(gè)平板的細(xì)胞分成2個(gè)平板進(jìn)行培養(yǎng)。(8)培養(yǎng)72 h后可進(jìn)行第2次轉(zhuǎn)染,方法同上。(9)96 h后收集經(jīng)過CD147 cDNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。(10)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blotting)檢測(cè)。

1.2.3G418篩選CD147超表達(dá)轉(zhuǎn)染細(xì)胞 配制梯度濃度分別為150、300、600、1 200 mg/mL,以確定G418的最佳篩選濃度。將CD147 cDNA轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種到含G418的培養(yǎng)基中,24 h后吸出上浮死掉的細(xì)胞,并再次更換培養(yǎng),10～15 d后將細(xì)胞移至96孔板擴(kuò)大培養(yǎng)。15 d后用胰蛋白酶溶解處理細(xì)胞,移至皿中培養(yǎng),并加入含G418的培養(yǎng)液,10 d后收集細(xì)胞,用于Western blotting,以篩選CD147最高表達(dá)的細(xì)胞。

表1 CD147的表達(dá)量

表2 Aβ40和Aβ42的生成量總含量

1.2.4收集細(xì)胞并分離純化蛋白 處理實(shí)驗(yàn)組(E)和對(duì)照組(C)細(xì)胞,并收集純化含γ分泌酶的樣本:(1)細(xì)胞破碎制備全蛋白C1和E1;(2)加入CHAPSO徹底溶解后,超速離心制備C2和E2;(3)用PS-1抗體純化C2或E2制備IPC2和IPE2。實(shí)驗(yàn)步驟:將E組和C組的細(xì)胞分別收集到2 mL的離心管,用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次,13 000 r/min 4 ℃離心2 min去液。加入0.5 mL勻漿緩沖液后,用細(xì)胞破碎針頭破碎40～50次,3 000 r/min離心5 min.取0.5 mL上清液,加入0.5 mL勻漿緩沖液,再破碎一次,保留上清液1 mL,分別取上清液0.2 mL,記為E1或C1,加入CHAPSO的Hepes buffer備用，將剩余上清液0.8 mL移入超速離心管,50 000 r/min離心60 min,以沉淀蛋白,加入含1％CHAPSO的Hepes buffer 0.2 mL。混合物于4℃ 空搖90 min,35 000 r/min離心30 min,取0.2 mL上清液,分別記為E2或C2。在所剩0.8 mL上清液中,加入30 μL ProteinG Beads,經(jīng)4 ℃搖動(dòng)90 min,然后13 000 r/min離心2 min,以棄除ProteinG Beads。上清液中加入2 μL PS1抗體與30 μL ProteinA Beads,置于垂直混合旋轉(zhuǎn)器上于4 ℃放置24 h經(jīng)13 000 r/min離心2 min得ProteinA Beads,用含CHAPSO的Hepes buffer清洗4次。吸附在ProteinA Beads上的蛋白即為γ分泌酶復(fù)合物,分別記為IPC2和IPE2。Western blotting 分析C1、E1、C2、E2、IPC2、IPE2中CD147的量。

1.2.5ELISA分析樣品C1、E1、C2、E2、IPC2及IPE2中γ分泌酶復(fù)合物活性 取上述樣本E1、C1、E2或C2 0.1 mL(蛋白濃度1.5 mg/mL)，加入3 μL底物C99(終濃度0.5 μmoL)，于37 ℃反應(yīng)7 h。將100 μL含 CHAPSO的Hepes buffer，3 μL C99加入IPE2和IPC2中于37 ℃進(jìn)行同樣反應(yīng)7 h。將上述反應(yīng)液50 μL以及Aβ40與 Aβ42的標(biāo)準(zhǔn)品分別加酶標(biāo)板中，加一抗50 μL于37 ℃孵育4 h。將上清液吸出，洗脫3次后，加入已配好的二抗稀釋液150 μL 37 ℃反應(yīng)60 min。再一次將上清液吸出，洗脫4次。然后加入穩(wěn)定發(fā)色液150 μL 37 ℃放置60 min，加入等量的終止液?；靹蚝鬁y(cè)產(chǎn)物。

2 結(jié) 果

2.1Western blotting分析CD147表達(dá)量 實(shí)驗(yàn)組E1、E2及IPE2中CD147表達(dá)量較相應(yīng)對(duì)照組樣本C1、C2和IPC2分別上升(11±5.5)％,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.08),上升(28.2±9.1)％,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)及上升(50.0±9.8)％,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.002),見表1。

2.2ELISA分析Aβ40和Aβ42的生成量 實(shí)驗(yàn)組所得E1、E2及IPE2與飽和濃度底物C99反應(yīng)生成的Aβ40和Aβ42總量均明顯低于同樣方法從對(duì)照組細(xì)胞制備所得樣本C1、C2及IPC2。參照樣本C1、C2及IPC2，經(jīng)CD147轉(zhuǎn)染，樣本E1、E2及IPE2 中所含γ分泌酶活性分別降低(61.8±3)％，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.25)，降低(82.9±5)％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，降低(190±7)％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。比較對(duì)照組樣本C1、C2及IPC2，在相同的條件下，樣本IPE2催化生成的短肽Aβ40和Aβ42含量最低，見表2。

2.3經(jīng)CD147超表達(dá)處理后MEF(KO)中CD147表達(dá)情況 見圖1。

圖1 CD147超表達(dá)后蛋白質(zhì)Western blotting分析結(jié)果

圖2 C1和E1中CD147蛋白質(zhì)含量的Western blotting分析結(jié)果

2.4C1、C2和E1、E2中CD147蛋白質(zhì)含量的Western blotting分析結(jié)果 CD147 cDNA超表達(dá)后實(shí)驗(yàn)組CD147表達(dá)量增加，見圖2、3。

2.5IPC2和IPE2中CD147蛋白質(zhì)含量的Western blotting分析結(jié)果 C2與E2經(jīng)PS-1特異性抗體免疫沉淀所得IPC2和IPE2，γ分泌酶復(fù)合物得到進(jìn)一步純化，見圖4。

2.6ELISA檢測(cè)樣本中所含γ分泌酶活性 隨著CD147的表達(dá)的進(jìn)一步增加，Aβ的表達(dá)量減少，可知γ分泌酶活性隨CD147表達(dá)量增高而負(fù)增長(zhǎng)，見圖5。

圖3 C2和E2中CD147蛋白質(zhì)含量的Western blotting分析結(jié)果

圖4 IPC2和IPE2中CD147蛋白質(zhì)含量的Western blotting分析結(jié)果

圖5 ELISA檢測(cè)樣本(C1、E1、C2、E2、IPC2和IPE2)中所含γ分泌酶活性

3 討 論

由于γ分泌酶切割C99是生成Aβ的最后一步也是限速步驟[10]，所以近期對(duì)γ分泌酶抑制劑的研究一直是個(gè)熱點(diǎn)，同時(shí)也是個(gè)難點(diǎn)。突出表現(xiàn)為抑制劑選擇性差。首先，淀粉斑塊是以Aβ42為核心，周圍聚集Aβ40。Aβ42極難溶解，但占Aβ的比例很小，而Aβ40是可溶的且還有其他未知的作用[11-12]。而選擇性差的抑制劑對(duì)于抑制Aβ40的生成作用強(qiáng)于Aβ42。其次，γ分泌酶在作用APP的同時(shí)也作用其他神經(jīng)遞質(zhì)，一旦生成或分解受阻，就會(huì)引起神經(jīng)系統(tǒng)中毒，其不良反應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于預(yù)期結(jié)果。 現(xiàn)階段，γ-分泌酶抑制劑主要包括抑制γ分泌酶酶解APP和抑制PS蛋白酶，實(shí)際上只是當(dāng)作工具藥來研究酶本身的結(jié)構(gòu)和功能[13]。選擇性、穩(wěn)定性、血腦屏障的穿越和細(xì)胞攝取等，都是研究抑制劑所必須考慮的。

既然Aβ42占Aβ總量的比例很小，只要使γ分泌酶的活性降低一定的值，就能相對(duì)減少Aβ42的生成量，達(dá)到理想的效果。如果抑制劑本身就是γ分泌酶復(fù)合體的組成成分且能調(diào)控γ分泌酶的活性，以上的一切問題就迎刃而解了。

研究證明蛋白CD147能夠調(diào)節(jié)導(dǎo)致淀粉體斑塊的產(chǎn)生[14-15]。利用靶向的RNA沉默細(xì)胞中的CD147，而γ分泌酶的組成亞基以及淀粉樣前體蛋白都不受這種沉默的影響。當(dāng)CD147被沉默時(shí)，Aβ的產(chǎn)量顯著增加了。

本實(shí)驗(yàn)通過第一步Western blotting檢測(cè)CD147蛋白的表達(dá)量，證明超表達(dá)細(xì)胞模型構(gòu)建成功。第二步的數(shù)據(jù)顯示超表達(dá)細(xì)胞模型可穩(wěn)定、高效的表達(dá)目的蛋白。第三步CHAPSO溶解膜蛋白復(fù)合物、超速離心使CD147得到了純化，證明CD147和跨膜蛋白結(jié)合緊密。特異性PS1抗體沉淀，使樣品進(jìn)一步純化，說明CD147可能是γ分泌酶的調(diào)控亞基。為進(jìn)一步研究其對(duì)γ分泌酶活性的影響奠定了基礎(chǔ)。

ELISA分析表明，隨著CD147的表達(dá)量增高，Aβ40和Aβ42的產(chǎn)量下降，證明CD147是γ分泌酶的負(fù)調(diào)控因子。

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