牟 華

(遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州 121001)

腦缺血再灌注損傷是指腦缺血恢復(fù)血液再灌注后，其缺血性損傷反而進(jìn)一步加重的現(xiàn)象。腦缺血再灌注損傷是一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程，可造成腦細(xì)胞損傷，引起嚴(yán)重神經(jīng)功能障礙，在臨床上具有較高致殘率和病死率。目前，臨床常用的治療藥物雖然在一定程度上有助于減輕損傷和促進(jìn)腦功能的恢復(fù)，但仍不能令人滿意[1]。促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一個(gè)營(yíng)養(yǎng)及保護(hù)因子，能對(duì)多種腦損傷模型起保護(hù)作用[2]。其機(jī)制可能是通過(guò)減輕損傷后炎癥反應(yīng)，抑制一氧化氮(NO)的合成及抗自由基，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡及抗氧化等作用對(duì)抗腦缺血再灌注損傷產(chǎn)生保護(hù)作用[3-4]。本研究擬通過(guò)研究EPO對(duì)大鼠腦缺血再灌注后腦組織中核因子-κB(NF-κB)表達(dá)水平的影響，為進(jìn)一步了解EPO對(duì)腦缺血再灌注損傷保護(hù)機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)成年SD大鼠45只，體質(zhì)量250～300 g，購(gòu)自遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，雌雄不限。

1.1.2主要試劑與藥品 重組人促紅細(xì)胞生成素購(gòu)自深圳生鵬生物科技有限公司；水合氯醛購(gòu)自東北制藥總廠；紅四氮唑(TTC)、NF-κB免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒、TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；DAB 顯色試劑盒購(gòu)自上海潤(rùn)成科技有限公司。

1.1.3主要儀器 HQP-2158J型切片機(jī)、HTP-100E烘片機(jī)購(gòu)自武漢海瑞特有限公司；雙目光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與給藥 45只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、腦缺血再灌注模型組(模型組)與EPO治療組(治療組)，每組15只。假手術(shù)組、模型組于再灌注前給予腹腔注射生理鹽水，治療組于再灌注前腹腔注射EPO(3 000 U/kg)。所有大鼠均單籠飼養(yǎng),自由飲水?dāng)z食。

1.2.2動(dòng)物模型建立 模型組與治療組參照相關(guān)文獻(xiàn)采用改良線栓法[5]將SD大鼠制成一側(cè)大腦中動(dòng)脈(MCA)阻斷缺血再灌注損傷模型。于大鼠腹腔注射10 g/L戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉，仰臥位固定，聚維酮碘消毒手術(shù)區(qū)后，于頸部正中切開(kāi)，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，用動(dòng)脈夾夾住頸總動(dòng)脈并結(jié)扎頸外動(dòng)脈，在頸總動(dòng)脈分叉處向頸內(nèi)動(dòng)脈插入尼龍線約(18.5±1.0)mm，至MCA起始部位出現(xiàn)明顯阻力感以完全阻斷血流，然后松開(kāi)動(dòng)脈夾，并結(jié)扎頸內(nèi)動(dòng)脈。術(shù)后縫合傷口，2 h后拔出尼龍線，即造成大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型。模型成功的標(biāo)志為爬行時(shí)向左轉(zhuǎn)圈或左側(cè)跌倒者，提尾時(shí)左前肢內(nèi)收屈曲。未達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)者為大鼠MCA缺血再灌注模型制作失敗，不納入實(shí)驗(yàn)組。凡有蛛網(wǎng)膜下腔出血者均不納入實(shí)驗(yàn)組。假手術(shù)組不插入尼龍線和結(jié)扎血管，其他步驟同上。

1.2.3神經(jīng)功能缺損評(píng)分 于缺血再灌注后4、12、24 h，對(duì)各組大鼠的神經(jīng)功能缺損進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[6]：0分為無(wú)神經(jīng)損傷癥狀；0.5 分為豎毛，輕度運(yùn)動(dòng)低下；1分為前肢屈曲,運(yùn)動(dòng)障礙；2分為行動(dòng)不協(xié)調(diào)，屈曲姿勢(shì)，向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分為偏癱，向?qū)?cè)傾倒，不能站立行走；4分為痙攣，嗜睡，意識(shí)喪失；5分為死亡。

1.2.4腦梗死體積的檢測(cè) 再灌注24 h后，用10%水合氯醛麻醉大鼠，斷頭取腦，生理鹽水沖洗后-20 ℃放置5 min，然后用雙面刀片沿冠狀切面切成5片，每片厚度 2 mm，置入盛有1%的TTC溶液中,37 ℃水浴30 min后置入10%多聚甲醛中固定。梗死部分呈蒼白色，正常部分呈紅色。拍照并輸入電腦，用圖像處理軟件計(jì)算腦梗死體積以及占同側(cè)大腦半球百分比。

1.2.5免疫組織化學(xué)檢測(cè)各組大鼠腦組織NF-κB蛋白表達(dá)情況 再灌注24 h后液氮處死大鼠，斷頭取大腦海馬組織，4 ℃多聚甲醛固定、脫水、浸蠟包埋后切成厚約3 μm的連續(xù)冠狀石蠟切片。經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水處理，3%過(guò)氧化氫溶液阻斷過(guò)氧化物酶活性，抗原修復(fù)，蒸餾水漂洗，加入適量的NF-κB一抗，漂洗、加二抗、PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，透明、封片等步驟,在光學(xué)顯微鏡下觀察,NF-κB蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色的顆粒，高倍鏡下每張切片隨機(jī)取10個(gè)不重復(fù)視野，顯微照相，記取陽(yáng)性細(xì)胞，輸入計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像分析。

1.2.6TUNEL法檢測(cè)各組大鼠腦細(xì)胞凋亡率 取海馬冠狀石蠟切片，常規(guī)二甲苯、乙醇脫蠟，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽(yáng)性凋亡的細(xì)胞。高倍鏡計(jì)數(shù)10個(gè)不重復(fù)視野中的細(xì)胞總數(shù)和凋亡陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞數(shù)，計(jì)算百分率。

2 結(jié) 果

2.1缺血再灌注后各組神經(jīng)功能缺損評(píng)分 從缺血后再灌注4、12、24 h后神經(jīng)功能評(píng)分可見(jiàn)，治療組與模型組大鼠4 h時(shí)神經(jīng)功能評(píng)分比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；12、24 h時(shí)治療組大鼠評(píng)分均有降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較±s,分)

△:P<0.05，與治療組同時(shí)間點(diǎn)比較。

2.2各組腦梗死體積比較 缺血后再灌注24 h，TTC染色后發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組大鼠腦組織呈均勻的紅色，無(wú)梗死灶；模型組大鼠腦組織出現(xiàn)蒼白色梗死灶，梗死邊界整齊、清晰；治療組大鼠腦組織梗死灶邊界不整齊，模糊不清。治療組腦梗死體積小于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組腦梗死體積比較±s)

△：P<0.05，與治療組比較。

2.3各組大鼠腦組織NF-κB蛋白表達(dá)情況 經(jīng)免疫組織化學(xué)檢測(cè)可見(jiàn)，再灌注24 h內(nèi)，模型組與治療組NF-κB蛋白表達(dá)有增加，但是治療組NF-κB蛋白表達(dá)比模型組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 各組NF-κB蛋白表達(dá)情況比較，%)

△：P<0.05，與治療組同時(shí)間點(diǎn)比較；★：P<0.05，與假手術(shù)組同時(shí)間點(diǎn)比較。

2.4各組大鼠腦組織神經(jīng)元凋亡細(xì)胞比較 應(yīng)用TUNEL法檢測(cè)各組大鼠腦組織神經(jīng)原細(xì)胞凋亡情況，光學(xué)顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞主要表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核黃染，核固縮，有大量棕黃色顆粒。在缺血再灌注后4、12、24 h時(shí)，與模型組比較，治療組大鼠平均凋亡細(xì)胞顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 各組神經(jīng)元凋亡細(xì)胞比較±s，%)

△：P<0.05，與治療組同時(shí)間點(diǎn)比較；★：P<0.05，與假手術(shù)組同時(shí)間點(diǎn)比較。

3 討 論

腦缺血再灌注損傷的發(fā)生與多種因素有關(guān)。NF-κB是一類普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，激活后可和許多基因啟動(dòng)子區(qū)域的固定核苷酸序列結(jié)合而啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄功能，通過(guò)調(diào)解編碼細(xì)胞因子、細(xì)胞黏附分子和一些生理與病理狀態(tài)下急性期蛋白的基因轉(zhuǎn)錄，在機(jī)體免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)等方面發(fā)揮重要作用[7-8]，其作用很可能是通過(guò)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路產(chǎn)生綜合效應(yīng)。研究表明，NF-κB激活可導(dǎo)致腦缺血再灌注神經(jīng)元凋亡，其機(jī)制尚不明確，可能是NF-κB的持續(xù)激活誘導(dǎo)細(xì)胞促凋亡基因的表達(dá)，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡[9-10]，并且，NF-κB激活后可誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子、黏附分子和趨化因子等的高表達(dá)，從而加重腦缺血再灌注損傷。因此，抑制NF-κB激活可成為防治腦缺血再灌注損傷的新策略。

EPO作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)一種很有前途的神經(jīng)保護(hù)劑，目前，在臨床治療腦血管病中的應(yīng)用日益受到關(guān)注。本研究觀察到，通過(guò)EPO治療，治療組大鼠腦組織中NF-κB蛋白表達(dá)明顯低于模型組，表明EPO可降低缺血腦灌注模型大鼠腦中NF-κB蛋白表達(dá)；通過(guò)TUNEL法檢測(cè)凋亡細(xì)胞證實(shí)EPO可通過(guò)減少神經(jīng)元凋亡而起到神經(jīng)保護(hù)作用。而缺血再灌注后各組大鼠神經(jīng)缺損評(píng)分與腦梗死體積檢測(cè)表明，EPO對(duì)腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。因此，從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，EPO可通過(guò)抑制NF-κB蛋白表達(dá)，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而起到保護(hù)大腦的作用。其抑制NF-κB蛋白表達(dá)的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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