安 敏，鮑百麗，趙 猛，韓 蕾

(遼寧省錦州市中心醫(yī)院心內科 121000)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DC)是糖尿病(diabetes meilitus，DM)常見的并發(fā)癥。據(jù)不完全統(tǒng)計，DC臨床發(fā)生率約75%[1]。有資料顯示，DM患者心力衰竭的發(fā)生率是非DM患者的2倍[2]。近來，有學者提出“氧化應激學說”，即氧化應激啟動并促進DM并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展。已有研究[3]提出，氧化應激參與DC發(fā)生、發(fā)展的各個環(huán)節(jié)。正常情況下機體氧化與抗氧化防御系統(tǒng)之間維持動態(tài)平衡，但過高濃度的葡萄糖導致細胞ROS產量明顯升高，抗氧化防御功能代償不足。血紅素氧合酶(heme oxygenase,HO)是一種廣泛存在的抗氧化防御酶,血紅素氧合酶-1(HO-1)，即誘導型[4]的血紅素加氧酶，其酶促反應及產物具有重要的生理意義。作為可誘導應激蛋白，HO-1已被廣泛認為是氧化應激中一種高度敏感和可靠的指標[5]，其產物膽綠素和其還原產物膽紅素能清除活性氧，CO依靠減輕氧化應激和炎癥反應保護細胞內質網(wǎng)免受應激[6]，亞鐵離子可誘導鐵蛋白的合成，后者可減少活性氧的產生，是一種天然的抗氧化酶。HO-1作為一種應激反應蛋白，參與了對抗高糖誘導的氧化損傷的防御機制。研究其在高糖引起的氧化應激造成的DM心肌病變中的作用是防治DM心肌病變的重要領域。

1 材料與方法

1.1動物分組及模型制備 健康SD大鼠64只，雌雄各半，體質量(250±20)g(遼寧醫(yī)學院實驗動物中心提供)，標準飼料，分籠專人喂養(yǎng)，大鼠自由飲水、進食，墊料干燥，所有大鼠置于光照周期12 h，25 ℃恒溫，濕度 40%～70%適應性喂養(yǎng)1周后開始實驗。隨機分為8組：空白6周(NC1)組、糖尿病6周(DM1)組、糖尿病加血紅素6周(HE1)組、糖尿病加原卟啉鋅(ZnPP)6周(ZN1)組；空白9周(NC2)組、糖尿病9周(DM2)組、糖尿病加血紅素9周(HE2)組、糖尿病加原卟啉鋅9周(ZN2)組，每組8只。NC1、NC2組正常飼料喂養(yǎng)；DM1、 HE1、ZN1、DM2、HE2、ZN2組給予高糖、高脂、高膽固醇飲食4周(20%蔗糖、10%煉豬油、5%膽固醇、2.5%膽酸鈉、62.5%基礎飼料，遼寧醫(yī)學院實驗動物中心提供)。然后DM1、 HE1、ZN1、DM2、HE2、ZN2給予小劑量腹腔注射STZ 30 mg/kg(溶于0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液,pH4.4),72 h后，3次血糖測定均值大于或等于16.7 mmol/L者納入實驗組；NC1、NC2組僅注射等量檸檬酸緩沖液。

表1 各組大鼠體質量及血糖統(tǒng)計表±s)

1.2主要試劑及儀器 氯高鐵血紅素(hemin,Sigma-aldrich,51280)，原卟啉鋅(ZnPP)(ALFA Asia,32068),連脲佐菌素(STZ)(Sigma-aldrich,s0130),兔抗大鼠HO-1一抗(Stressgen,SPA-895D),二抗試劑盒(北京中杉金橋，SP9000)，膽固醇、膽酸鈉(河南平頂山市東珠生物制品有限公司),DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3處理方法 成模2 d后給藥，HE1、HE2組和ZN1、ZN2組分別腹腔注射Hemin(15 mg/kg)、ZnPP(10 μmol/kg) 6、9周，每周2次。NC1、DM1組和NC2、DM2組注射生理鹽水(10 mL/kg)6、9周,每周2次。每周稱體質量2次，根據(jù)體質量注射藥量；每周測血糖，剔除未成模大鼠。

1.4氧化應激指標檢測 應用硫代巴比妥酸法測定MDA含量,黃嘌呤氧化酶法測定SOD活力,二硫代二硝基苯甲酸法測定GSH-Px含量,具體操作步驟參照試劑盒說明書。

1.5心肌形態(tài)學觀察 實驗室處死大鼠后，分離心臟，取左心室部分制作石蠟切片，切片經(jīng)10%甲醛浸泡固定,常規(guī)脫水、透明、包埋、切片，留作免疫組織化學法檢測應用。1 mm3心肌左心室標本置于預冷載玻片上，2.5%戊二醛、鋨酸雙重固定，乙醇脫水，環(huán)氧樹脂包埋，制備超薄切片，鉛-鈾雙重染色，電子顯微鏡下觀察超微結構。

1.6大鼠心肌HO-1的表達情況檢測 免疫組化：石蠟切片脫蠟至水→梯度乙醇水化→抗原高壓修復→山羊血清封閉→兔抗大鼠一抗4 ℃過夜→PBS沖洗→生物素化二抗→PBS沖洗→辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素→DAB顯色→復染→封片。胞漿褐色顆粒為陽性細胞，PBS代替一抗做陰性對照，每個標本在400倍下隨機選取5個不重疊陽性視野經(jīng)圖像采集系統(tǒng)采集圖片后計算累計光密度值。

2 結 果

2.1大鼠體質量及血糖監(jiān)測 大鼠在造模過程及以后的飼養(yǎng)過程中因為感染及血糖過高DM1、DM2、HE1組各死亡1只，HE2、ZN1、ZN2組各死亡2只。STZ處理大鼠各組之間體質量及血糖比較，差異無統(tǒng)計學意義，但ZN、DM組體質量要低于HE治療組，血糖高于HE治療組。STZ處理大鼠血糖和體質量與空白組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表1。

2.2心肌氧化應激指標檢測 在第6、9周，心肌氧化應激指標檢測結果，DM、Zn組心肌SOD、GSH-PX與NC比較均明顯降低,MDA明顯升高(P<0.05或<0.01);而HE組心肌SOD、GSH-PX均值低于NC組；MDA高于NC組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；HE組心肌SOD、GSH-PX水平均高于DM、Zn組；MDA低于DM、Zn組(P<0.05或<0.01)；而9周與6周各組兩兩相比，氧化應激水平均高于后者，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2、3。

表2 第6周不同組心肌氧化應激檢測指標比較±s)

表3 第9周不同組心肌氧化應激檢測指標比較±s)

2.3大鼠心肌電子顯微鏡觀察 第6、9周NC組大鼠心肌超微結構可見肌原纖維豐富，縱向平行排列，肌絲排列緊密整齊；Z線和M線清晰可見：線粒體圓形或橢圓形；ZN2組可見心肌細胞排列紊亂，質膜模糊、斷裂；肌原纖維呈灶性溶解，肌絲成分減少，扭曲、斷裂，肌節(jié)對位不齊；線粒體有斷嵴、空泡樣變性現(xiàn)象；HE2組僅見心肌細胞內線粒體數(shù)目增加、體積減小，線粒體有斷嵴，未見空泡樣變性，心肌肌原纖維尚完整；DM2組超微結構改變介于NC2、ZN2組之間。第6周組心肌超微結構改變介于空白組與9周各組之間，見圖1。

2.4心肌組織HO-1免疫組化結果 本研究顯示，HO-1蛋白表達于心肌細胞質，各組表達差異明顯，DM、HE組心肌細胞HO-1陽性染色顆粒明顯增多，且HE組比DM組增加更明顯(P<0.05)；而ZN組心肌細胞HO-1陽性染色顆粒表達最少，與DM組、HE組、NC組比較差異均有統(tǒng)計學意義，分別為(P<0.05)、(P<0.01)和(P<0.05)。9周組比6周組表達減少，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；將顯色結果輸入IMS細胞圖像分析系統(tǒng)，分析結果見表4。

A～H：分別代表NC1、DM1、HE1、ZN1、NC2、DM2、HE2、ZN2組。

圖1各組心肌電子顯微鏡超微結構比較(×15 000)

表4 免疫組化照片密度結果±s)

3 討 論

HO-1是目前發(fā)現(xiàn)的受最多因素誘導的應激蛋白,可被血紅素、金屬元素、紫外線照射、化學物質、高血糖、某些藥物、GSH 耗竭等因素誘導激活。有研究證實糖尿病患者淋巴細胞HO-1水平高于正常組[6]。本實驗結果表明，高血糖及血紅素可誘導大鼠心肌HO-1蛋白高表達，抑制劑ZnPP可抑制HO-1表達。DM大鼠各組體質量及血糖比較差異無統(tǒng)計學意義，但ZN、DM組體質量均值低于HE組，血糖高于HE組，與文獻[7]經(jīng)過2個月血紅素治療和未經(jīng)血紅素治療的STZ誘導的DM大鼠體質量沒有顯著性差異，但是僅在經(jīng)過血紅素處理的大鼠出現(xiàn)抗DM效應相符。說明HO-1在胰島素釋放和糖代謝方面起重要作用[8]。

越來越多的證據(jù)表明，氧化應激參與了DM引起的各種血管病變[9]。誘導HO-1高表達是氧化應激的一種普遍標志,是對氧化應激的一種有益的適應性反應[10]?；蜣D染使細胞高表達HO-1可防止高糖誘導的8-epi-PGF2a水平升高，提示HO-1在對抗高糖誘導的氧化損傷中發(fā)揮了十分重要的作用，高糖和AGEs對THP.1細胞造成氧化損傷，表現(xiàn)為細胞ROS產量、氧化損傷指標MDA水平和炎癥因子TNFa分泌增加[11]。本實驗DM、ZN組心肌抗氧化應激指標SOD、GSH-PX與HE組比較均明顯降低,MDA明顯升高且差異有統(tǒng)計學意義；通過對HO-1免疫組化密度和氧化應激指標SOD、GSH-PX、MDA的分析可以看出，SOD、GSH-PX水平與HO-1免疫組化密度成正比，MDA水平與其成反比。說明雖然DM組HO-1表達增加，可能是細胞為拮抗氧化損傷所做出的適應性和代償性反應，但生理性代償并不足以拮抗細胞氧化應激，氧化應激水平反而升高。HE組通過血紅素誘導HO-1表達增加，提高了大鼠抗氧化應激水平，應用血紅素提高2型DM大鼠心肌HO-1表達水平可降低心肌氧化應激。

文獻報道，STZ誘導DM大鼠心肌細胞超微結構的改變在8～12周[12]，尤其是線粒體損傷。本研究通過在電子顯微鏡下觀察第6、9周不同時間段大鼠心肌線粒體及心肌纖維超微結構的改變及與心肌HO-1水平的關系，發(fā)現(xiàn)2型糖尿病大鼠心肌線粒體及心肌纖維損傷在第6周時已經(jīng)出現(xiàn)，并且隨時間變化而嚴重；但是心肌超微結構在第6周時變化并不明顯，第9周損傷才表現(xiàn)得更加明顯。超微結構損害以ZN組最為明顯，DM組次之，而血紅素治療組心肌超微結構損害與前述組相比明顯減輕，這與上述報道相一致。說明誘導2型糖尿病大鼠心肌HO-1高表達對心肌氧化應激導致的超微結構損傷具有保護作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)，隨時間推移，在第6、9周，2型DM大鼠心肌HO-1表達量呈逐漸下降趨勢，心肌氧化應激水平有逐漸上升趨勢，心肌超微結構損傷也更加明顯，但在兩個時間段之間HO-1表達量及心肌氧化應激水平并無顯著性差異，可能與觀察時間比較短有關，因此，需要更進一步研究。通過其他途徑進一步誘導DM狀態(tài)下HO-1的表達增高可能有助于拮抗心肌細胞氧化損傷，這為DM心肌病防治提供了一條新的思路。

[1]Buyer JK，Thanigaraj S,Schechtman KB,et al.Prevalence of ventricular diastolic dysfunction in asymptomatic normotensive patients with diabetes mellitus[J]．Am J Cardiol,2004,93(7):870-875.

[2]Cougblin SS,Pearle DL，Baughman KL,et al.Diabetes mellitus and risk of idiopathic dilated cardiumyopathy the Washington,DC dilated cardiomy-opathy study[J].Ann Epidemiol，1994,4(1):67-74.

[3]Hamblin M,Friedman DB,Hill S,et al.Alterations in the diabetic myocardial proteome coupled with increased myocardi-al oxidative stress underlies diabetic cardiomyopathy[J].Mol Cell Car,2007,42(7)：884-895.

[4]Maines MD.The heme oxygenase system:past,present,and future[J].Antioxid Redox Signal,2004,6(5):797-801.

[5]Abraham NG,Kappas A.Pharmacological and clinical aspects of heme-oxygenase[J].Pharmacol Rev,2008,60(1):79-127.

[6]JoeY,ZhengM,KimSK,etal.Theroleofcarbonmonoxideinmetabolicdisease[J].AnnNYAcadSci,2011,122(1):156-161.

[7]Ndisang JF,Jadhav A.Heme oxygenase system enhances insulin sensitivity and glucose metabolism in streptozotocin-induced diabetes[J].Am J Physiol Endocrinol Metab,2009,296(8):829-841.

[8]Calabrese V,Cornelius C,Koverech G,et al.Oxidative stress,glutathione status,sirtuin and cellular stress response in type 2 diabetes[J].Biochim Biophys Acta,2011,12(1):3-5.

[9]Brownlee M．Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications[J]．Nature，2001,414(6):813-820.

[10]McLaughlin B,Hartnett KA,McLaughlin B,et al.Caspase-3 activation is essential for neurop rotection inp reconditioning [J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(6):715-720.

[11]Nishikswa T,Edelstein D,Du XL,et al.Normalizing mitochon-drial superoxide production blocks three pathways of hypergly-caemic damage[J].Nature,2000,404(7):787-790.

[12]Thompson EW.Structural manifestions of diabetic cardiomyopathy in the rat and its reversal by insulin treatment[J].Am J Ana,1988,182(3):270-282.