任碧瓊，李 勇，鄒國英，徐國鋒，徐 飛

(湖南省第二人民醫(yī)院檢驗科，長沙 410007)

眾所周知，癌癥死亡占疾病死亡首位，成功治療的關鍵在于早期診斷，腫瘤標志物的研究一直是熱點。人們試圖開發(fā)抗腫瘤抗原的自身抗體，而不再是瞄準血清抗原作為生物標志[1]，而腫瘤相關抗原多是自身蛋白質往往沒有太多的免疫原性[2-4]，如抗CT抗原NY-ESO-1自身抗體在原發(fā)性乳腺癌患者中檢出率僅占4%[5]，抗CT抗原SCP-1及SSX-2自身抗體分別為6%和1%[6]，所以，需進一步努力鑒別免疫原性腫瘤抗原。近年，國外學者發(fā)現精子相關抗原-9(sperm-associated antigen 9,SPAG9)不僅在腫瘤組織表達的陽性率超過80%(蛋白水平和RNA水平)，而且該抗原免疫原性強，能引起腫瘤患者較強的體液免疫反應，產生相應抗體。有報道[12]抗SPAG9抗體在卵巢上皮癌患者血清中的陽性檢出率為67%，并在活體內各種組織類型的早期階段(Ⅰ～Ⅱ期) 表現出高的抗SPAG9免疫活性，而健康人血清中完全沒有。另外，有一個較高的SPAG9免疫反應積分的獨特模式，與乳腺癌復發(fā)顯著相關[13]。這些研究為進一步大規(guī)模證明腫瘤早期診斷和治療打下基礎。本研究采用SPAG重組蛋白建立ELISA對86例腫瘤患者血清中的SPAG9自身抗體進行檢測，結果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 以2009年7月至2010年9月湖南省第二人民醫(yī)院腫瘤科的86例腫瘤患者為研究對象，其中，男61例，女25例，年齡(54±11)歲。肺癌37例，肝癌27例，其他癌22例，見表1。健康對照組22例，其中，男14例，女8例，來自湖南省第二人民醫(yī)院健康體檢中心，實驗室檢查未見任何異常。所有腫瘤均結合病理切片、超聲、CT、磁共振、腫瘤標志物等檢查確診。

表1 86例腫瘤患者一般情況

1.2方法

1.2.1標本收集 采集腫瘤患者空腹血3～5 mL，放置20 min，3 000 r/min離心10 min分離血清，-80 ℃冰箱低溫保存。健康對照組同樣條件采集與保存。

1.2.2SPAG9檢測 采用臺灣Abnova公司提供的SPAG9重組蛋白作為抗原建立ELISA。包被96孔板，每孔100 ng抗原，體積60 μL，放置4 ℃冰箱過夜；然后取出用洗板機洗板5次，每次1 min；加封閉液每孔200 μL，37 ℃放置2 h；加入稀釋后的樣本每孔100 μL，37 ℃放置1 h然后再洗板5次，每次1 min。加稀釋后的酶標二抗，每孔100 μL，37 ℃放置1 h；再洗板5次，每次1 min；分別加A、B顯色液每孔50 μL，37 ℃放置45 min后加終止液50 μL然后在酶標儀上450 nm和620 nm波長比色。參照文獻[7]，共檢測86例腫瘤患者及22例健康人血清抗SPAG9抗體滴度，本次研究的最佳條件為：SPAG9重組蛋白包被量為每孔100 ng，血清1∶10稀釋，酶標儀比色波長450 mm和620 mm。以健康人吸光值均數加2倍標準差作為陽性判斷標準。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS11.5軟件進行χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1各腫瘤患者組及對照組檢測情況 86例腫瘤患者血清中SPAG9免疫反應總體陽性率為32.6%，肝癌組陽性率為48.1%，肺癌組為16.2%，其他腫瘤組為40.8%，健康對照組為4.54%。肝癌組及其他腫瘤組與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義，見表2、圖1。

表2 各腫瘤患者組及對照組檢測情況

-：表示此項無數據。

2.2各腫瘤組OD值的分布情況 在肝癌組及其他癌癥組患者中OD值比較分散，有較強免疫反應患者；肺癌組患者OD值相對集中，未見強免疫反應患者，見圖2。

圖1 各組SPAG9免疫反應陽性率

圖2 各組OD值分布

3 討 論

SPAG9是2004年發(fā)現的癌-睪丸抗原家族的新成員，作為一種支架蛋白與JNK(c-Jun-NH2-knase)結合，參與JNK信號通路，在細胞的生存、增殖、凋亡和腫瘤的發(fā)育等生理過程中扮演重要調節(jié)角色[8-9]。SPAG9是一個單拷貝基因定位于人類染色體17q21[9]，這個區(qū)域是各種癌癥中的一個與癌基因的擴增與表達有關的區(qū)域。腫瘤抗原的血清學分析揭示抗原編碼在17q21，提示基因編碼在17號染色體這一區(qū)域增強表達是腫瘤的一個關鍵事件[10]，所以，SPAG9在活體內的表達特征能作為腫瘤進犯和臨床結果的分子標志。

國外一系列研究報道SPAG9在活體內有著很強的體液免疫反應，在卵巢上皮癌中占67%[11]，乳腺癌中占80%[12]，腎癌中77%[13]，子宮頸癌中80%[14]，甲狀腺癌中78%[15]，而慢性粒細胞白血病中高達88%[16]，由此可以推導，SPAG9是免疫原性腫瘤抗原，其自身抗體有望成為很好的腫瘤早期診斷指標。

作者的初步研究顯示，在86份腫瘤患者血液標本中有28例表現出SPAG9體液免疫反應性，總敏感度為32.6%，其中肺癌的敏感度為16.2%，肝癌為48.1%，其他癌為40.9%；22例對照組中只有1例陽性；特異性為95.5%。雖然本研究的SPAG9自身抗體的陽性率(即敏感度)低于文獻報道，但已能初步了解到腫瘤患者外周血中抗SPAG9自身抗體的表達遠遠高于健康人，并且肝癌患者的體液免疫反應較強，至今尚未發(fā)現國內外文獻報道。腸道、女性相關的腫瘤也表現出較強的免疫反應，相比之下肺癌的免疫反應較弱，這可能與肺部組織的結構特點有關，也可能是入組患者經過各種治療效果良好、疾病得到有效控制的緣故。同時作者所采用的ELISA方法的特異性達到95.5%，出現假陽性概率僅為4.5%，說明實驗方法特異性較好。但是，若要得到更加理想的實驗結果有必要重新收集初診、未經任何治療的患者標本進一步研究?？偟膩碚f，本研究抗SPAG9自身抗體的陽性率低于國外文獻報道的原因可能有如下幾方面：(1)因為研究對象大多數為已經過放療、化療或者陀螺刀治療的患者而不是腫瘤初診患者，諸多的治療因素干擾研究結果，這也提示SPAG9與腫瘤細胞存活的關系很值得研究；(2)ELISA的條件有待優(yōu)化，抗原包被量以及標本稀釋比例有待進一步摸索。另外，需擴大腫瘤患者病例樣本數，嚴格的分期分級，并同時擴大健康對照樣本數進行檢測。本研究初步證實SPAG9的免疫原性，發(fā)現抗SPAG9自身抗體在各種腫瘤患者外周血中有不同程度的表達，尤其在肝臟腫瘤患者的血清中檢出較高的陽性率，值得進一步研究。

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