覃彥平，秦 雪

(1.廣西壯族自治區(qū)柳州市紅十字會(huì)醫(yī)院檢驗(yàn)科 545001;2.廣西醫(yī)科大學(xué)，南寧 530021;3.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)中心，南寧 530021)

肝癌是人類最常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，全世界每年新發(fā)肝癌患者約60萬(wàn)人，位居惡性腫瘤的第5位。中國(guó)發(fā)病人數(shù)約占全球的50%以上，全球 55%肝癌病例發(fā)生在中國(guó)[1]。研究證實(shí)白介素-23R(IL-23R)基因的某些多態(tài)性位點(diǎn)與胃癌、卵巢癌、食管癌等有關(guān)[2-4]。但I(xiàn)L-23R基因多態(tài)性與肝癌的遺傳易感性的關(guān)系尚不清楚。本研究對(duì)IL-23R基因rs10889677A/C、rs1884444G/T兩個(gè)位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性(SNP)進(jìn)行檢測(cè)，以探討這兩個(gè)位點(diǎn)與肝癌的遺傳易感相關(guān)性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 實(shí)驗(yàn)分肝癌組和對(duì)照組2組，肝癌組84例，為2010年6～10月在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院因肝癌住院，未經(jīng)化療、放療的患者，其中男73 例，女11 例，年齡21～69歲，中位年齡47.5 歲，HBsAg陽(yáng)性84 例(100%)，AFP陽(yáng)性55 例(65.5%)，肝功能ALT平均值為152.1 U/L，全部病例均經(jīng)臨床和病理檢查確診為肝癌。對(duì)照組94例，為同期健康體檢者，其中男74 例，女21 例，年齡21～69歲，中位年齡44.5 歲，所有對(duì)照組體檢結(jié)論為健康合格者。所有研究對(duì)象和實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的獲得均符合倫理學(xué)原則。

1.2DNA標(biāo)本 所有未經(jīng)化療、放療的肝癌組患者和健康對(duì)照者均抽取外周靜脈血5 mL,EDTA抗凝，采用苯酚-氯仿法提取外周血白細(xì)胞基因組DNA，置于-20 ℃冰箱備測(cè)。

1.3引物設(shè)計(jì) IL-23R基因的rs10889677、rs1884444兩個(gè)基因序列PCR擴(kuò)增引物參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)[5-6]。引物由上海生工生物有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.4聚合酶鏈反應(yīng) 采用DA-7300PCR反應(yīng)儀，試劑購(gòu)自Fermentas公司。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括基因組DNA 2.0 μL，上下游引物(1 μmol/L)各1 μL，Dream TaqTM Green PCR Master Mix(2x)12.5 μL,不足體積用滅菌去離子水補(bǔ)充至25 μL。IL-23R基因rs10889677位點(diǎn)的PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性2 min,94 ℃變性30 s,62.8 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,36個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。IL-23R基因rs1884444位點(diǎn)的PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)除退火溫度為56 ℃外，其他反應(yīng)條件同rs10889677。取產(chǎn)物5 μL經(jīng)含有EB的2%瓊脂糖凝膠電泳，觀察PCR擴(kuò)增是否成功。

1.5擴(kuò)增產(chǎn)物的限制性酶切 酶切反應(yīng)體系均為20 μL，包括PCR產(chǎn)物10 μL，限制性內(nèi)切酶(10 U/μL)1μL，反應(yīng)緩沖液2 μL，滅菌去離子水補(bǔ)充至20 μL,37 ℃酶切過(guò)夜。其中rs10889677位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶為Mnll,rs18844444位點(diǎn)則為HeaⅢ(限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自Fermentas公司)。酶切產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn) DNA marker同步電泳(含EB的3%瓊脂糖凝膠電泳)，觀察基因型。

1.6基因型判斷 (1) IL-23R基因rs10889677位點(diǎn)。CC基因型：完全切開(kāi)，酶切產(chǎn)物有154 bp和62 bp兩條帶；CA基因型：未完全切開(kāi)，酶切產(chǎn)物有216、154和62 bp 3條帶；AA基因型：不能切開(kāi)，酶切產(chǎn)物只有216 bp 1條帶。(2) IL-23R基因rs18844444位點(diǎn)。GG基因型：完全切開(kāi)，酶切產(chǎn)物有117 bp和19 bp兩條帶；GT基因型：未完全切開(kāi)，酶切產(chǎn)物有136、117和 19 bp(片段太小，電泳不可見(jiàn))3條帶；TT基因型：不能切開(kāi)，酶切產(chǎn)物只有136 bp 1條帶。

M:對(duì)照組;9：CA基因型；5、6：CC基因型；1、2、4、7、8、10：AA基因型。

1.7測(cè)序鑒定 隨機(jī)抽取10%的樣本送至上海生工生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序儀器為ABI-PRISM3730。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 對(duì)照組和肝癌組經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)分析后，采用直接計(jì)數(shù)計(jì)算基因型和等位基因頻率；各組間等位基因頻率和基因型分布頻率差異采用χ2檢驗(yàn)和危險(xiǎn)性分析，計(jì)算比值比(OR)和95%可信區(qū)間(95%CI)。采用PLINK軟件構(gòu)建IL-23R基因rs1884444和rs10889677兩個(gè)位點(diǎn)的單倍型并進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1IL-23R基因rs10889677、rs1884444位點(diǎn)酶切結(jié)果和測(cè)序結(jié)果 限制性內(nèi)切酶產(chǎn)物經(jīng)電泳分析后發(fā)現(xiàn)IL-23R基因rs10889677、rs1884444酶切后均可產(chǎn)生3種基因型，見(jiàn)圖1、圖2。測(cè)序結(jié)果和酶切結(jié)果均吻合。

2.2Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) 經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)IL-23R基因rs10889677、rs1884444位點(diǎn)對(duì)照組和肝癌組基因型實(shí)際值與預(yù)測(cè)值比較結(jié)果P值分別為0.775、0.387，P>0.05，均符合Hardy-Weinberg平衡，顯示本研究所檢測(cè)樣品具有代表性和可比性。

2.3IL-23R基因rs10889677、rs1884444位點(diǎn)肝癌組和對(duì)照組基因型及等位基因型分布比較 見(jiàn)表2。

表2 IL-23R基因rs10889677、rs1884444位點(diǎn)基因型、等位基因型在肝癌組和對(duì)照組中的分布[n(%)]

由表2可見(jiàn)肝癌組與對(duì)照組比較，IL-23R基因rs10889677位點(diǎn)AA、AC、CC基因型及A、C等位基因型分布比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。IL-23R基因rs1884444位點(diǎn)TT、TG、GG基因型及T、G等位基因型分布比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。顯示IL-23R基因rs1884444基因多態(tài)性與肝癌的遺傳易感性有關(guān)。危險(xiǎn)分析顯示T等位基因型與G等位基因型相比其OR值為1.636，95%CI為1.027～2.607，提示攜帶T等位基因型的個(gè)體較攜帶G等位基因型者發(fā)生肝癌的風(fēng)險(xiǎn)增加1.636倍。

2.4IL-23R基因rs10889677、rs1884444位點(diǎn)單倍型分析 采用PLINK軟件對(duì)rs1884444和rs108896772兩個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行單倍型構(gòu)建，共構(gòu)建出4種單倍型。由表4可見(jiàn)GA單倍型與肝癌的患病風(fēng)險(xiǎn)性有相關(guān)性(P=0.020 9),攜帶 GA單倍型的個(gè)體患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)增加至1.72。其他單倍型與肝癌的患病風(fēng)險(xiǎn)性無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。

表3 IL-23R基因rs10889677、rs1884444位點(diǎn)單倍型在肝癌組和對(duì)照組中的分布

3 討 論

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)已有多種炎性細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路參與肝癌的發(fā)生、發(fā)展[5]。IL-23是一種與腫瘤有關(guān)的炎癥性細(xì)胞因子[6]。IL-23R是IL-23受體復(fù)合物的2個(gè)亞基之一，主要的生物學(xué)作用是介導(dǎo)IL-23在細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)。IL-23需通過(guò)與其相應(yīng)的IL-23受體復(fù)合物結(jié)合才能發(fā)揮其生物學(xué)功能。當(dāng)IL-23與IL-23R結(jié)合后，可引發(fā)下游信號(hào)通路Jak2、Tyk2分子的激活，磷酸化受體胞內(nèi)區(qū)的Stats結(jié)合位點(diǎn)，使Stats分子以二聚體方式聚集，磷酸化的Stats二聚體入核后，激活靶基因的轉(zhuǎn)錄。IL-23與IL-23R還能誘導(dǎo)記憶性CD4+T細(xì)胞向TH17細(xì)胞分化[7]。TH17細(xì)胞可高表達(dá)IL-17，并分泌大量促炎因子如：IL-6和TNF-α等[8]。TH17細(xì)胞可介導(dǎo)炎性反應(yīng)、自身免疫性疾病、腫瘤等疾病的發(fā)生、發(fā)展[9]。而致炎細(xì)胞因子IL-17可以促進(jìn)多種細(xì)胞亞群及巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF、IL-8等促炎細(xì)胞因子，引起細(xì)胞浸潤(rùn)和組織破壞[10]。上述炎癥因子構(gòu)成了IL-23/IL-23R/TH17/IL-17通路，該通路是引起機(jī)體炎癥及免疫紊亂的重要組成部分。由于腫瘤可源自慢性炎癥[11]，Kuang等[12]揭示腫瘤可激活單核細(xì)胞分泌IL-23等細(xì)胞因子，觸發(fā)TH17細(xì)胞分化和增殖；TH17細(xì)胞分泌的IL-17累積在肝癌中通過(guò)引起血管生成而促進(jìn)疾病的進(jìn)展。而作為IL-23/IL-23R/TH17/IL-17通路信號(hào)傳遞因子的IL-23R也極有可能與肝細(xì)胞癌變有關(guān)。本研究首次探討了IL-23R rs10889677A/C及IL-23 R rs1884444G/T兩個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性與肝癌的關(guān)系。本研究結(jié)果顯示IL-23R基因rs1884444位點(diǎn)基因型、等位基因型分布頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。危險(xiǎn)分析顯示攜帶T等位基因型的個(gè)體較攜帶G等位基因型者發(fā)生肝癌的風(fēng)險(xiǎn)高。各單倍型中只有GA單倍型與肝癌的患病風(fēng)險(xiǎn)性有相關(guān)性(P=0.020 9)。說(shuō)明了IL-23R基因rs1884444位點(diǎn)基因多態(tài)性可能與肝癌遺傳易感性有關(guān)。而IL-23R基因rs10889677位點(diǎn)基因型、等位基因型分布頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。該位點(diǎn)與肝癌的遺傳易感性無(wú)明顯相關(guān)性。

本研究的IL-23R rs10889677A/C及IL-23R rs1884444G/T兩個(gè)位點(diǎn)均為Haploview上的標(biāo)簽SNP，分別位于外顯子11和外顯子2，二者都是由于堿基的取代而出現(xiàn)SNP(rs1884444是T→G，rs10889677是A→C)?；蛐蛄兄袉蝹€(gè)核苷酸的替代、插入或缺失，都會(huì)引起編碼氨基酸的改變或?qū)е罗D(zhuǎn)錄的mRNA剪接的改變，影響基因表達(dá)與蛋白質(zhì)的功能，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。IL-23R基因多態(tài)性與食管癌、胃癌等的研究已證實(shí)IL-23R可能與某些炎癥相關(guān)的腫瘤易感性有關(guān)。Zhang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，IL-23R可通過(guò)交替剪接產(chǎn)生剪接異構(gòu)體，并優(yōu)先在肺癌中表達(dá)，進(jìn)而推測(cè)該表達(dá)可能有助于細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視或攻擊，使IL-23R可能在某些癌癥的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮作用。Chen和Hsich[14]證實(shí)，IL-23R信號(hào)通路中的Stats3調(diào)控多種與細(xì)胞增殖及凋亡有關(guān)的功能蛋白的表達(dá)，Stats3的異?；罨且鹱訉m內(nèi)膜癌的原因之一。本研究顯示，與肝癌遺傳易感性相關(guān)的IL-23R rs1884444基因位于外顯子2，后者負(fù)責(zé)編碼IL-23R的信號(hào)肽[15]，信號(hào)肽的功能是決定新生肽鏈在細(xì)胞中的定位或決定某些氨基酸殘基修飾。雖然rs1884444已被報(bào)道與胃癌及食管癌等的遺傳易感性相關(guān)，但rs1884444的功能目前還不明確，有待于進(jìn)一步的功能學(xué)研究。

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